田興中，凌曉紅，李藝鋒，武佐元

(貴陽中醫(yī)學院 實驗中心，貴州 貴陽550002)

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Morris水迷宮法探討化風丹對大鼠空間記憶能力的影響

田興中，凌曉紅*，李藝鋒，武佐元

(貴陽中醫(yī)學院 實驗中心，貴州 貴陽550002)

目的：比較萬勝化風丹、廖元和堂化風丹、氯化汞(HgCl2)和亞砷酸鈉(NaAsO2)對健康SD大鼠空間記憶能力的影響。方法：清潔級SD大鼠每天分別喂食萬勝化風丹(420mg·kg-1，含汞10.9mg·kg-1，含砷8.8mg·kg-1)、廖元和堂化風丹(420mg·kg-1，含汞10.9mg·kg-1，含砷8.8mg·kg-1)、HgCl-2(5mg·kg-1，含汞3.7g·kg-1)、NaAsO-2(5mg·kg-1，含砷2.9mg·kg-1)以及空白對照組，持續(xù)60天，使用Morris水迷宮(MWM)法檢測其空間學習能力。結(jié)果：用藥前大鼠潛伏期在第1～4天無明顯變化，訓練第5天各組潛伏期顯著下降；用藥后訓練第1～5天各組潛伏期呈明顯下降趨勢。與正常組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后HgCl2組在第2～5天均有顯著性差異(P<0.05)，萬勝化風丹組、廖元和堂化風丹組及去NaAsO2組僅在第4天差異顯著(P<0.05)；與HgCl2組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后萬勝化風丹組、廖元和堂化風丹組和NaAsO2組在第2～5天均差異顯著(P<0.05)。結(jié)論：HgCl2長期應用可顯著降低大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的空間記憶能力，化風丹對此無明顯影響。

萬勝化風丹；廖元和堂化風丹；HgCl2；NaAsO2；Morris水迷宮

化風丹是受國務院保護的四大名藥之一，由藥母、麝香、天麻、僵蠶、全蝎、雄黃、朱砂等15味名貴中藥材配伍經(jīng)過獨特的下窖發(fā)酵及風干工藝制作而成，主治風痰閉阻(頭痛、耳鳴、腦動脈硬化、肢體麻木無力及腦萎縮)、癲癇、中風偏癱、面神經(jīng)麻痹等，是世界上生產(chǎn)及銷售時間最長的治療腦部疾病的中成藥。化風丹中含礦物藥朱砂和雄黃，是其治療腦部疾病產(chǎn)生藥理作用的重要成分[1]。然而，朱砂、雄黃各自的主要成分HgS、α-As4S4是國際公認毒物汞、砷元素的化合物，其安全性問題深受國內(nèi)外關(guān)注。由化風丹主治病癥可知，神經(jīng)系統(tǒng)是其發(fā)揮藥效的重要靶器官，對于這方面的研究，目前少有相關(guān)報道。本研究從長期用藥角度，給予大鼠喂食臨床等效劑量萬勝化風丹、廖元和堂化風丹和去朱砂化風丹60天，觀察其與HgCl2、NaAsO2對大鼠空間記憶能力影響的異同。

Morris水迷宮(MWM)是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設(shè)計的，用于研究實驗室大鼠空間學習與記憶能力以及評價神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、藥物作用之間的關(guān)系的裝置，在當代神經(jīng)科學研究中占據(jù)十分重要的位置[2-3]。目前，有相當多的試驗者利用水迷宮來評價動物的學習與記憶能力[4]，最常用的評價指標是定位航行實驗的“逃避潛伏期”[5]。另外，我們采用每天第1次訓練的成績作為評價指標，這樣反映出的是大鼠對前一天的記憶力[6]。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

健康清潔級SD大鼠，雄性，160～200g，清潔級，購自重慶滕鑫比爾實驗動物銷售有限公司，動物許可證號SCXK(渝)2007-0005。大鼠在實驗環(huán)境中適應性常規(guī)喂養(yǎng)3d，保證大鼠每天充足的飼料和飲水，光照12h。篩選出達到學習標準的大鼠30只，將其隨機分為5組(n=6)為萬勝化風丹組(萬勝組)、廖元和堂化風丹組(廖元和堂組)、HgCl2組、NaAsO2組和對照組。

1.2 主要藥品

廖元和堂化風丹購自貴州廖元和堂藥業(yè)公司，批號120315；萬勝化風丹購自貴陽萬勝藥業(yè)有限責任公司，批號120307；HgCl2購自貴州省萬山特區(qū)礦產(chǎn)公司，批號1110003；NaAsO2購自山東西亞化學工業(yè)有限公司，批號20130301。

1.3 主要儀器

Morris水迷宮由不銹鋼水池(圓柱狀)、可移動平臺和圖像自動采集、處理系統(tǒng)等組成。水池直徑150cm，高70cm；平臺直徑15cm，高40cm；水池四個象限有不同符號的導航標識。

1.4 定位航行試驗

定位航行實驗是通過大鼠在水中尋找平臺的逃避潛伏期來檢測大鼠學習能力的，方法如下：(1)將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置取第二象限起始位置。記錄動物找到水下平臺的時間(s)，即逃逸潛伏期。在前幾次訓練中，如果這個時間超過90s，則引導動物到平臺，在平臺上停留30s。(2)將大鼠移開，放在150W的白熾燈下5min，放回籠內(nèi)。1只動物每天訓練2次，上午、下午各1次，連續(xù)訓練5d，并記錄訓練成績。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

各給藥組大鼠每日食量、飲水量以及排便均未發(fā)現(xiàn)異常，毛色柔順有光澤，體重穩(wěn)定上升，各給藥組無顯著性差異，實驗過程中無死亡。

2.2 定位航行試驗

用藥前大鼠潛伏期在第1天至第4天無明顯變化，訓練第5天各組潛伏期顯著下降；用藥后訓練第1～5天各組潛伏期呈明顯的下降趨勢，且萬勝化風丹組、廖元和堂化風丹組、NaAsO2組以及正常組在第2～5天與用藥前比較均具有顯著性差異(P<0.05) (見表2～5)，HgCl2組僅在第4天與用藥前比較有顯著性差異(P<0.05) (見表4)；與正常組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后HgCl2組在第2～5天均有顯著性差異(P<0.05) (見表2～5)，萬勝化風丹組、廖元和堂化風丹組和NaAsO2僅在第4天差異顯著(P<0.05) (見表4)；與HgCl2組比較，用藥前各組在第1～5天均無顯著差異，用藥后萬勝化風丹組、廖元和堂化風丹組和NaAsO2組在第2～5天均差異顯著(P<0.05) (見表2～5)。

表1 大鼠第1天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表2 大鼠第2天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表3 大鼠第3天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表4 大鼠第4天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

表5 大鼠第5天逃避潛伏期結(jié)果

與給藥前比較aP<0.05; 與正常組比較bP<0.05; 與HgCl2組比較cP<0.05。

3 討論

用藥前，各組大鼠每天訓練的潛伏期無顯著差異，即各組大鼠在用藥前的空間記憶能力相當，表明篩選方式是正確且成功的，這為后期實驗的順利進行奠定了堅實的基礎(chǔ)。

3.1 大鼠用藥前后每天訓練結(jié)果差異討論

與用藥前訓練成績比較，用藥后各組大鼠的潛伏期均有明顯的下降趨勢，表明大鼠在喂養(yǎng)60天后，經(jīng)過1天的適應性訓練，對給藥前的訓練結(jié)果具備一定程度的遠期記憶能力。而HgCl2組大鼠的這一能力與其他組比較并不顯著，從這一角度來看，HgCl2的長期應用減弱了大鼠的空間記憶能力。

3.2 大鼠用藥后每天各組訓練結(jié)果差異討論

用藥后，正常組大鼠每天訓練的潛伏期呈顯著下降趨勢，萬勝組、廖元和堂組和NaAsO2組與正常組的趨勢相同，且無顯著性差異，表明兩種化風丹和NaAsO2對大鼠空間記憶能力無明顯影響。而HgCl2組在第2～5天的潛伏期均顯著高于正常組及其他給藥組，提示HgCl2的長期應用可減弱大鼠的空間記憶能力。

綜上所述，HgCl2的長期應用對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的空間記憶能力具有顯著的影響，這主是由于HgCl2是無機汞，與朱砂中主要成分HgS存在形式不同，導致其對腦組織的不同影響。

[1] ZHANG F,LU YF,WU Q,et al．Role of cinnabar and realgar of WSHFD in protecting against LPS-induced neurotoxicity[J]．Journal of Ethnopharmacology, 2012，139 (3): 822-828.

[2] VASCONCELLOS AP,ZUGNO AI,DOS SANTOS AH．Na+, K+-ATPase activity is reduced in hippocampus of rats submitted to an experimental model of depression: effect of chronic lithium treatment and possible involvement in learning deficits[ J]．Neurobiol Learn Mem, 2005, 84(2): 102-110.

[3] CHOEIRI C,HEWITT K,DURKIN J．Longitudinal evaluation of memory performance and peripheral neuropathy in the Ins2C96YAkita mice[J]．Behav Brain Res, 2005, 157(1): 31-38.

[4] BRANDEIS R,BRANDYS R,YEHUDA S.The use of the Morris water maze in the study of memory and learning[ J]．Neuroscience,1989, 48(1-2): 29-69.

[5] 陳羅西，郭玲玲，李亮．Morris 圓形水迷宮的應用及其相關(guān)檢測指標分析[J]．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008，10( 8) : 55．

[6] 羅小泉，駱利平，陳海芳，等．Morris 水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討[J]．時珍國醫(yī)國藥,2010,21(10):2667-2669.

(責任編輯：李嵐春)

2014-01-17

田興中，貴陽中醫(yī)學院碩士研究生，研究方向為中藥藥理及毒理學。

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1673-2197(2014)08-0012-02