葛啟隆,岳秀萍,王國英 (太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山西 太原 030024)

一株苯酚降解菌的分離鑒定及響應(yīng)面法優(yōu)化其固定化

葛啟隆,岳秀萍*,王國英 (太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山西 太原 030024)

從太原市焦化廠廢水活性污泥中分離、篩選出一株苯酚降解細(xì)菌,經(jīng)生理生化反應(yīng)和16S rRNA鑒定,該菌株為Diaphorobacter屬細(xì)菌,命名為 PD-07.代謝機(jī)制研究表明,苯酚可誘導(dǎo)該菌合成鄰苯二酚 2,3-加氧酶降解苯酚.為了提高該菌株對(duì)苯酚的降解率,以海藻酸鈣為材料,對(duì)該菌株進(jìn)行包埋固定化研究.首先采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響固定化菌株苯酚降解率的關(guān)鍵因素,然后采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大苯酚降解率響應(yīng)區(qū)域.最后用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面回歸分析,應(yīng)用二次方程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得,擬合曲線與實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值相關(guān)性良好,最佳條件為海藻酸鈉濃度3.83%(m/V)、CaCl20.3mol/L、菌膠比1:26.73、固定化時(shí)間2h、搖床轉(zhuǎn)速180r/min、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH值7.2、液固比4.86:1,在此條件下苯酚降解率可達(dá)96.89%.

Diaphorobacter sp.PD-07；Plackett-Burman；海藻酸鈉；固定化細(xì)胞；苯酚；生物降解；響應(yīng)面法

℃

苯酚是煤氣、造紙等工廠排出廢水中主要污染物之一[1],水體中5～25mg/L的濃度即可對(duì)魚類的生存構(gòu)成威脅[2],因此,含酚廢水的治理具有重要意義.目前,降解苯酚的方法主要包括吸附法,電化學(xué)法以及生物降解法等[3-5],其中生物降解法因低成本,無污染而被廣泛采納[6].

研究表明,具有降解苯酚能力的微生物主要有假單胞菌(Pseudonomonas.sp)[7]、芽孢桿菌(Bacillus.sp)[8]、酵母菌(Yeast trichosporon)[9]、根瘤菌(Rhizobia)[10]、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(A. calcoaceticus)[11]等,其中,大部分研究主要集中在酵母菌、芽孢桿菌以及假單胞桿菌上,對(duì) Diaphorobacter屬的細(xì)菌研究鮮見報(bào)道.由于高濃度含酚廢水對(duì)活性污泥中微生物生長(zhǎng)有一定抑制作用[12],而固定化細(xì)胞技術(shù)因具有可固定優(yōu)勢(shì)菌種,提高污染物降解效率,抗毒性強(qiáng)以及延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等優(yōu)點(diǎn),在降解含酚廢水方面表現(xiàn)出很大潛力.與傳統(tǒng)活性污泥法相比,固定化細(xì)胞具有生物密度大,剩余污泥量小,反應(yīng)過程易于控制等優(yōu)點(diǎn)[13].

固定化微生物方法多種多樣,其中以海藻酸鈣為載體的包埋法最為普遍[14],該法固定的微生物存活力高,傳質(zhì)性能好,在反應(yīng)工程中應(yīng)用靈活

[15],但其可變影響因素較多[16],因此有必要從諸多影響因素中篩選出最為重要的影響因素,由于單因素實(shí)驗(yàn)不能確定主要因素、次要因素,而Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)是基于不完全平衡塊原理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),能夠從諸多因素中快速有效地篩選出最重要的因素[17].響應(yīng)面法是一種優(yōu)化過程的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,其中Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法比較常用[18].該法對(duì)各影響因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià),建立曲面模型,確定最佳水平,與正交設(shè)計(jì)相比,該法所需實(shí)驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少,更能直觀體現(xiàn)因變量最佳值[19].

本研究從焦化廢水活性污泥中分離、篩選得到一株苯酚降解菌,并對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定及苯酚代謝途徑分析.依據(jù)影響固定化細(xì)胞制備條件(海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度等)和培養(yǎng)條件(pH值、溫度、液固比等)等因素依次進(jìn)行 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和 Box-Behnken實(shí)驗(yàn),對(duì)影響固定化細(xì)胞苯酚降解率的相關(guān)因素進(jìn)行了篩選和優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 所用篩選菌株的活性污泥采集自太原市某焦化廠廢水生物處理系統(tǒng).

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)[20]:胰蛋白 10,酵母浸出粉 5, NaCl 10, pH 7.2～7.4.

自制選擇培養(yǎng)基(g/L):K2HPO40.5, KH2PO40.5, CaCl20.1,NH4Cl 0.5, MgSO4·7H2O 0.2, MnSO4·H2O 0.01, Fe2(SO4)3·H2O 0.01, NaNO31.0, NaMoO4·2H2O 0.01,苯酚按需要量加入,pH 7.2～7.4.

以上培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20min,固體平板和斜面培養(yǎng)基均在上述培養(yǎng)基中加入 2%的瓊脂粉.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活性污泥的馴化 在液體培養(yǎng)基中利用苯酚作為唯一碳源進(jìn)行梯度馴化,同時(shí),在馴化的過程中觀察微生物生長(zhǎng)情況,60d后,活性污泥體系基本達(dá)到穩(wěn)定.

1.2.2 菌株的分離純化 取馴化后的培養(yǎng)液1mL,將其倍比稀釋至 10-8,將稀釋度為 10-2～10-8的菌液涂布于 LB平板培養(yǎng)基上,在生物培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 72h.根據(jù)菌落形態(tài)(形狀,大小,隆起程度,透明程度,邊緣形狀和菌落顏色的差別)挑取高度分散的單菌落至營養(yǎng)瓊脂斜面上進(jìn)一步劃線分離,通過鏡檢確定其為純菌后,保存在 4℃的冰箱中備用.

1.2.3 苯酚降解菌株的篩選 將所有純化的菌株分別接種至裝有 LB培養(yǎng)液的三角瓶中,在搖床中連續(xù)活化 2代,并將次級(jí)培養(yǎng)物活化至吸光度為1.20左右(以LB培養(yǎng)基做空白,此時(shí)微生物處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期),接種到選擇培養(yǎng)基中,搖瓶振蕩培養(yǎng),每隔一定時(shí)間檢測(cè)培養(yǎng)物中苯酚濃度,從中選出苯酚降解率最高的菌株.

1.2.4 菌株的鑒定 參照文獻(xiàn)[21]做該細(xì)菌的生理生化鑒定,16S rRNA測(cè)序由深圳華大基因研究院完成.

1.2.5 細(xì)胞粗酶液的提取 將篩選出的菌株接種到唯一碳源培養(yǎng)液(含100mg/L苯酚)和LB培養(yǎng)基中,30℃,180r/min搖床培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期菌液 10mL, 4℃,12000r/min高速離心5min,收集菌體,上清液留取待用,菌體用 pH=7磷酸鹽緩沖液清洗兩次,然后用磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞,置于冰水混合物中,用JY92-IIN型超聲破碎儀破碎細(xì)胞,再次離心 20min,收集上清液即為粗酶液[22].

1.2.6 細(xì)菌DNA的提取 細(xì)菌DNA提取參見文獻(xiàn)[23].

1.2.7 PCR反應(yīng) 以基因組DNA為模板擴(kuò)增,鄰苯二酚-2,3加氧酶(C23O)引物為(5′-CCAGC AAACACCTCGTTGCGGTTGCC-3′)和(5′-AG AGGCATGGGGGCGCACCGGTTCGATCA-3′),鄰苯二酚-1,2加氧酶(C12O)引物為(5′-CGCCT TCAAAGTTGATCTGCGTGGT-3′)和(5-GCCA ACGTCGACGTCTGGCA-3′)[24],PCR 反應(yīng)體系:10×Taq聚合酶緩沖液5μL,MgCl2(25mmol/L) 3.75μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,引物各 1.25(10μmol/L)μL,模板 DNA 1μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL,加重蒸水至50μL.C23O的PCR程序如下:94℃變性 60s,57℃退火 45s,72℃延伸 60s,30個(gè)循環(huán), 72℃最終延伸5min;C12O的PCR程序如下:94℃變性 60s,50℃退火 30s,72℃延伸 45s,30個(gè)循環(huán),72℃最終延伸5min.測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與 Genbank數(shù)據(jù)庫中已收錄的基因序列進(jìn)行同源性比較.

1.2.8 固定化細(xì)胞的制備 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的種子培養(yǎng)液吸入離心管中,4000r/min離心10min,棄去上清液,生理鹽水清洗3次.所得菌體制成4mL菌液與海藻酸鈉混合,將混合物通過針筒滴入 CaCl2溶液中,交聯(lián)沉淀,制成固定化細(xì)胞顆粒,攪拌一段時(shí)間后,4℃中靜置硬化 24h,再用生理鹽水洗滌備用[25].以上操作均在無菌條件下進(jìn)行.

1.2.9 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究以苯酚降解率為響應(yīng)目標(biāo),采用三步法進(jìn)行優(yōu)化,首先用Plackett- Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選出對(duì)固定化細(xì)胞苯酚降解率影響較大的因素,然后用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定響應(yīng)面分析的中心點(diǎn),最后利用響應(yīng)面法中 Box- Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響固定化細(xì)胞苯酚降解率的因素進(jìn)一步研究,通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型,最終確定最佳條件,并進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析借助 Minitab和 Design Expert軟件.

1.3 測(cè)定與分析方法

細(xì)胞濃度的測(cè)定采用可見分光光度法,在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度(OD600).細(xì)胞干重采用干燥恒重法測(cè)量,根據(jù)細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度轉(zhuǎn)換為細(xì)胞干重;取培養(yǎng)液吸入離心管內(nèi),控制轉(zhuǎn)速離心后將上清液棄去,離心管倒置數(shù)分鐘,隨即稱量,濕菌體重量=離心后重量-離心管重量[25];苯酚濃度的測(cè)定:4-氨基安替比林直接光度法[27];鄰苯二酚-1,2-加氧酶(C12O)活力測(cè)定:以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物(粘糠酸)在 260nm處吸光度變化表示,鄰苯二酚-2,3加氧酶(C23O)活力測(cè)定:以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物(2-羥基粘糖酸半醛)在 375nm 處吸光度變化表示[28],測(cè)定系統(tǒng)總體系9mL,內(nèi)含0.3mmol/L反應(yīng)底物8.01mL,磷酸緩沖液(pH=7.0)0.39mL和0.6mL粗酶液,以磷酸緩沖液為參比.定義C12O(或C23O)活力單位(U)為25℃條件下每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1μmol粘糠酸(或 2-羥基粘糖酸半醛)所需酶量.總蛋白含量用Bradford法測(cè)定[29],酶的比活力以每毫克的蛋白質(zhì)中所含酶的活力單位數(shù)計(jì)算.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法,從焦化廢水活性污泥中分離純化,篩選得到單菌落,應(yīng)用涂布劃線等純化手段,得到24株苯酚降解細(xì)菌,再根據(jù)苯酚降解實(shí)驗(yàn)復(fù)篩得到一株苯酚降解能力最高的菌株,其編號(hào)為 PD-07,該菌 72h對(duì)初始濃度1400mg/L苯酚降解率為80.36%,其形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果如下:菌落為圓形、表面光滑、不透明、端生鞭毛、短桿狀、無芽孢、無莢膜;革蘭氏染色陰性、氧化酶陽性、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性、V-P實(shí)驗(yàn)陰性、明膠液化陰性、淀粉水解陰性、甲基紅陰性、硝酸鹽還原陽性、葡萄糖產(chǎn)酸陰性.

經(jīng)16S rRNA測(cè)序獲得的序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中已收錄的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較分析得,該菌株16S rRNA序列(Genbank 中的登 錄 號(hào) 為 :KF022039)與 Diaphorobacter nitroreducens具有 99%的同源性,結(jié)合該菌株的形態(tài)和生理學(xué)特性,初步判斷該菌株為Diaphorobacter屬細(xì)菌,命名為 Diaphorobacter sp.PD-07.

2.2 苯酚代謝途徑及酶特性分析

分別采用引物 C12O、C23O 對(duì)菌株Diaphorobacter sp.PD-07的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物C23O有明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物,而 C12O幾乎沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物.對(duì)擴(kuò)增的C23O基因測(cè)序后采用Blast程序?qū)υ撔蛄羞M(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)該片段與GeneBank中已登錄的AB266139.1鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的序列相比有 98%的同源性,表明菌株P(guān)D-07基因組中還具有鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因.

1)根據(jù)果園環(huán)境特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了果園紅外測(cè)溫系統(tǒng)測(cè)量果樹的樹冠、果實(shí)、枝葉以及果園環(huán)境等溫度，減少了測(cè)量?jī)x對(duì)測(cè)量目標(biāo)的溫度干擾，降低了成本，利于農(nóng)業(yè)自動(dòng)化和精細(xì)農(nóng)業(yè)等相關(guān)技術(shù)的推廣及應(yīng)用。

在有氧條件下苯酚被苯酚羥化酶轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚,鄰苯二酚進(jìn)一步被鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶或鄰苯二酚 2,3-加氧酶催化進(jìn)行鄰位或間位開環(huán)[30].通過測(cè)定菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶液中鄰苯二酚 1,2-加氧酶和鄰苯二酚 2,3-加氧酶的活性,初步判斷該菌株降解苯酚的代謝途徑.菌株Diaphorobacter sp.PD-07粗酶活性檢測(cè)如表 1所示,在以苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中,菌體粗酶液中鄰苯二酚 2,3-加氧酶的比活力為0.298U/mg蛋白質(zhì),而鄰苯二酚1,2-加氧酶的比活力僅為0.009U/mg蛋白質(zhì),因此推斷該菌株降解苯酚以間位開環(huán)降解為主.菌體破碎后上清液中鄰苯二酚 2,3-雙加氧酶的活性遠(yuǎn)高于未破碎菌體上清液中酶活性,這表明該酶為胞內(nèi)酶.以LB培養(yǎng)基(不含苯酚)為基質(zhì)的兩種上清液酶的活性均未檢測(cè)到,說明該菌株鄰苯二酚 2,3-加氧酶是誘導(dǎo)酶.

表1 不同基質(zhì)中鄰苯二酚加氧酶比活力(U/mg蛋白質(zhì))Table 1 Catechol dioxygenase specific activities in different substrates (U/mg protein)

2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定影響固定化細(xì)胞苯酚降解率的主要因素

采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的8個(gè)因素進(jìn)行研究,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2與表3,應(yīng)用Minitab軟件分析得模型的P=0.021,說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信.苯酚降解率回歸分析復(fù)相關(guān)系數(shù)為R2=98.35%,說明回歸分析能夠確切的描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).根據(jù)回歸分析結(jié)果,可知海藻酸鈉濃度、菌膠比(菌體濕重與膠液體積之比)以及液固比(培養(yǎng)液體積與固定化小球總體積之比)對(duì)苯酚降解率存在顯著影響,其中,液固比P值最小(P=0.003),對(duì)固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率影響最顯著,其次是海藻酸鈉濃度(P=0.036),再次為菌膠比(P=0.048).其他 5個(gè)因素,CaCl2濃度,固定化時(shí)間,搖床轉(zhuǎn)速,培養(yǎng)溫度,初始pH值P值均大于 0.05,對(duì)固定化細(xì)胞苯酚降解率沒有顯著影響.由此,篩選出3個(gè)影響固定化細(xì)胞苯酚降解率的關(guān)鍵因素.

表2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table 2 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of Plackett-Burman experiment

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)(Steepest ascent design)逼近最佳值區(qū)域

當(dāng)逼近最佳值區(qū)域時(shí)才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[31],故用最陡爬坡法快速逼近最大苯酚降解率區(qū)域.最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4.

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and the results of steepest ascent

2.5 響應(yīng)面法(Response Surface Methodology)分析及最佳條件的確立

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5.應(yīng)用Design Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合后,編碼方程模型為:

式中:Y為苯酚降解率;A、B、C分別為海藻酸鈉濃度、菌膠比、液固比的編碼值.

圖 1散點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)所得苯酚降解率,表明實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值的偏離程度.其中散點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)值結(jié)果,直線為預(yù)測(cè)值擬合直線.通過圖1及回歸模型方差分析和系數(shù)檢驗(yàn)(表6)得到,模型復(fù)相關(guān)系數(shù) R2=0.9969,表明固定化細(xì)胞苯酚降解率實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間有很好的擬合度.失擬項(xiàng)0.1214,差異不顯著;校正決定系數(shù) R2Adj=0.9928,表明僅有 0.72%的固定化細(xì)胞苯酚降解率變異不能由該模型進(jìn)行解釋.另外,統(tǒng)計(jì)學(xué)中Cook距離,即Di表明某一條數(shù)據(jù)記錄被排除在外,由此造成的回歸系數(shù)變化有多大,通常認(rèn)為 Di<1時(shí),該數(shù)據(jù)為合理數(shù)據(jù)[32].由圖2分析也可知,用于診斷各種回歸分析中是否存在異常數(shù)據(jù)的 Di值均分布在小于 1的理想范圍內(nèi),不存在對(duì)回歸系數(shù)的計(jì)算產(chǎn)生明顯影響的數(shù)據(jù),說明二次多項(xiàng)式很好地?cái)M合了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),因此該模型可用來對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及固定化菌株Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的實(shí)測(cè)值Table 5 Box-Behnken experimental design and measured values of phenol biodegradation rate of immobilized strain Diaphorobacter sp.PD-07in alginate

由表6中實(shí)驗(yàn)結(jié)果的F值可檢驗(yàn)各因素的顯著性,根據(jù)響應(yīng)面分析三維圖(圖 3～圖 5),可直觀地看出各因素之間的交互作用,各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,且對(duì)響應(yīng)值的影響存在一極值點(diǎn).由表6回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可得,海藻酸鈉濃度、菌膠比及液固比這 3個(gè)因素對(duì)固定化細(xì)胞苯酚降解率的影響高度顯著,其中海藻酸鈉濃度、液固比和菌膠比、液固比之間對(duì)響應(yīng)值的兩兩交互影響均非常顯著,海藻酸鈉濃度、菌膠比之間對(duì)響應(yīng)值的交互影響不顯著.在3D響應(yīng)面圖中表現(xiàn)為圖4、圖5的曲面較陡峭,Z軸的值域較大,而圖3的曲面相對(duì)平緩,Z軸值域范圍相對(duì)較小.

表6 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 6 Results of regression analysis of the Box-Behnken design

圖1 回歸模型苯酚降解率預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的關(guān)系Fig.1 Relationship between predicted value and actual value of regression model

將模型構(gòu)建的方程進(jìn)行偏導(dǎo)微分處理,得到最佳理論水平為:A =-0.34,B =-0.26,C =-0.28,即:海藻酸鈉濃度3.83 %(m/v)、菌膠比1:26.73、液固比 4.86:1.此時(shí),固定化細(xì)胞苯酚降解率的最大預(yù)測(cè)值為97.35 %.

圖2 回歸模型的Cook距離分布Fig.2 Distribution of Cook’s distance of regression model

圖3 以苯酚降解率為響應(yīng)值海藻酸鈉濃度與菌膠比的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface plotted on Sodium alginate concentration and bacteria-cement ratio

圖4 以苯酚降解率為響應(yīng)值海藻酸鈉濃度與液固比的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface plotted on Sodium alginate and liquid-solid ratio

圖5 以苯酚降解率為響應(yīng)值菌膠比與液固比的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface plotted on bacteria-cement ratio and liquid-solid ratio

2.6 模型驗(yàn)證及分析

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性,在預(yù)測(cè)的最佳條件下進(jìn)行 3組平行實(shí)驗(yàn),所得苯酚平均降解率為96.89%,可見回歸方程得到苯酚去除率的理論預(yù)測(cè)值與其實(shí)驗(yàn)值非常接近,誤差僅為0.46%.固定化細(xì)胞與游離態(tài)細(xì)胞對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中僅有2.3%的苯酚被去除,這說明苯酚蒸發(fā)及海藻酸鈣凝膠小球(未包埋細(xì)菌)吸附作用對(duì)實(shí)驗(yàn)影響甚微,可忽略不計(jì).固定化細(xì)胞苯酚降解時(shí)間比游離態(tài)細(xì)胞降解時(shí)間略短,這很可能是因?yàn)榫驮摼甓?與高濃度苯酚對(duì)其抑制作用相比,海藻酸鈣凝膠小球?qū)Φ孜锏膫髻|(zhì)阻礙作用相對(duì)較小,這與 Wu 等[33]對(duì)固定化菌株 Yarrowia lipolytica W29降解廢水中COD研究結(jié)果一致.

圖6 固定化細(xì)胞與游離態(tài)細(xì)胞對(duì)苯酚的降解Fig.6 Phenol degradation by free and immobilized cells of strain Diaphorobacter sp. PD-07

3 結(jié)論

3.1 從活性污泥中分離得到一株苯酚降解菌,經(jīng)生理生化反應(yīng)及 16S rRNA 測(cè)序鑒定為Diaphorobacter屬細(xì)菌.該菌株可利用苯酚作為唯一碳源和能源,72h對(duì)初始濃度1400mg/L苯酚降解率為 80.36%,命名為 Diaphorobacter sp. PD-07.

3.2 通過測(cè)定鄰苯二酚雙加氧酶的活性,初步認(rèn)為在苯酚的生物降解過程中,由苯酚羥化酶催化轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚,再由鄰苯二酚 2,3-雙加氧酶將其轉(zhuǎn)化為2-羥基粘糖酸半醛,鄰苯二酚2,3-雙加氧酶是該菌株催化鄰苯二酚開環(huán)的誘導(dǎo)型關(guān)鍵酶.

3.3 采用 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響海藻酸鈉包埋固定化菌株 Diaphorobacter sp.PD-07苯酚降解率的主要因素,即海藻酸鈉濃度、菌膠比和液固比,其中液固比為影響最大的因素.

3.4 應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法確定固定化苯酚降解菌株的最佳條件為:海藻酸鈉 3.83%(m/v)、CaCl20.3mol/L、菌膠比1:26.73、固定化時(shí)間2h、搖床轉(zhuǎn)速180r/min、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH值7.2、液固比 4.86:1.在此條件下苯酚降解率可達(dá)96.89%.

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Isolation and identification of a phenol-degrading strain and optimization for its immobilization using response

surface methodology.

GE Qi-long, YUE Xiu-ping*, WANG Guo-ying (College of Environmental Science and Engineering,

Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China). China Environmental Science, 2014,34(2)：518～525

A phenol-degrading strain was isolated from the activated sludge of a cokes wastewater treatment facility in Taiyuan City. Based on its physiology, biochemical characters and the analysis of its 16S rRNA gene sequence, the isolated strain named PD-07 was identified as a member of the genus Diaphorobacter. Metabolic pathway research showed that the strain could be induced to synthesize intracellular catechol-2,3-dioxygenase.To improve the phenol degradation rate, a study of embedding immobilized strain was conducted with calcium alginate as material. Firstly, factors playing important roles in the phenol degradation rate of immobilized cell were selected based on Plackett-Burman design. Then the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the phenol degradation rate. Finally, the optimal levels of those main factors were further optimized by using Box-Behnken design and response surface analysis. Quadratic equation was adopted to fit the test data. The fitting curve had a good correlation with the measured values. The optimal conditions were as follows: alginate concentration 3.83%(m/V), calcium chloride concentration 0.3mol/L, bacteria-cement ratio 1:26.73, immobilized time 2h, rotation rate 180r/min, culture temperature 30 , initial pH value 7.2, liquid-solid ratio 4.86:1. Under the optimal conditions mentioned above, the phenol degradation rate reached 96.89%.

Diaphorobacter sp. PD-07；Plackett-Burman；sodium alginate；immobilized cell；phenol；biodegradation；response surface methodology

X172

：A

：1000-6923(2014)02-0518-08

葛啟隆(1988-),男,山西運(yùn)城人,太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物及水污染控制研究.

2013-06-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51378330);山西省青年科技研究基金(2013021023-3);山西省環(huán)境保護(hù)廳環(huán)保科研項(xiàng)目(201205)

* 責(zé)任作者, 教授, yuexiuping1990@126.com