高艷，李厚華，李玲，王亞杰，徐曼

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100）

紫葉李葉片色素成分分析

高艷，李厚華，李玲，王亞杰，徐曼

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100）

紫葉李Prunus cerasifera是常見的園林綠化觀葉樹種，其葉片在整個生長季節(jié)均為紫紅色。以紫葉李葉片為試驗(yàn)材料，利用高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器、紫外-可見分光光度計(jì)、薄層色譜分析法對紫葉李葉片的色素種類及含量進(jìn)行了定性和定量分析。結(jié)果表明：紫葉李葉片內(nèi)含有類胡蘿卜素、葉綠素（葉綠素a為主）、矢車菊素、矮牽牛素、矢車菊素半乳糖苷、天竺葵素及其他單體酚（槲皮素、蘆丁、二氫楊梅酮等）。其中，矢車菊素半乳糖苷、矢車菊素和葉綠素的共存互作是其葉片呈現(xiàn)紫紅色的主要原因，類胡蘿卜素、槲皮素、蘆丁等輔助色素也起到了輔助成色的作用。圖6表2參24

植物學(xué)；紫葉李；色素；成色機(jī)制；矢車菊素半乳糖苷

紫葉李Prunus cerasifera為薔薇科Rosaceae李屬Prunus落葉小喬木，其葉片色彩獨(dú)特、樹姿婀娜，較其他紅色葉樹種具長勢迅速、樹型優(yōu)良、觀賞期長等特點(diǎn)，通常被應(yīng)用于園林綠地及觀賞樹種，效果甚佳。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對園林綠化的重視程度不斷提高，國內(nèi)外出現(xiàn)越來越多關(guān)于觀賞樹種花、葉等器官的成色機(jī)制與環(huán)境影響因素相關(guān)性的研究成果。Deal[1]的研究表明紅葉雞爪槭Acer palmatum會因晝夜溫差變大而出現(xiàn)葉色褪失的現(xiàn)象；彩葉秋海棠Begonia purpureofolia和紫葉矮櫻Prunus cistena‘Pissardii'會在較強(qiáng)光照下呈現(xiàn)深紫色，若光照減弱，葉片中花青苷合成量減少，導(dǎo)致葉色偏綠影響最佳觀賞效果[2]；萬壽菊Tagetes erecta葉片中花青苷的合成與低溫、高輻射和高光強(qiáng)等諸多環(huán)境因素有關(guān)[3]；紫葉李、金葉接骨木Sambucus racemosa的日照時間超過12 h時，葉片顏色會更加鮮艷[4]。到目前為止，對紫葉李葉色的研究多集中于內(nèi)外環(huán)境與花青苷的相關(guān)性分析[5-6]，對其葉片各類色素的提取與成分的定性、定量分析未有報(bào)道。本研究從紫葉李葉片中提取相關(guān)色素，并運(yùn)用紫外-可見分光光度計(jì)、薄層層析色譜法和高效液相色譜儀對提取的色素進(jìn)行定性與定量分析，確定了其葉片成色的主要色素成分，以期為紫葉李品種改良、利用基因工程等手段調(diào)控葉片成色機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集生長于西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)內(nèi)的紫葉李向陽面紫紅色葉片為試材，采集時間為2012年6月。將采集的葉片表面用流水沖洗干凈，輕柔吸干表面水珠后置于-80℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2 試劑與主要儀器

試劑中色譜級甲醇、乙腈購自Spectrum公司；類黃酮標(biāo)準(zhǔn)樣品根皮素、對香豆酸和蘆丁購自天津一方科技有限公司；表兒茶素、槲皮素和兒茶素購自天津金測分析技術(shù)有限公司；其余標(biāo)品均購自Sigma公司。儀器為高效液相色譜-二極管陣列檢測儀（日立L-2000）、紫外-可見分光光度計(jì)（島津-2450）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料的預(yù)處理取保存于-80℃冰箱中的紫葉李葉片，真空冷凍干燥72 h后研磨成粉待用。

1.3.2 色素萃取葉綠素與類胡蘿卜素萃取參考高俊鳳[7]的方法并改進(jìn)。在葉綠素萃取方法中，先稱取0.50 g粉末，再用體積分?jǐn)?shù)為90%丙酮溶液[V（丙酮）∶V（乙醇）=9∶1]萃取并定容至20.0 mL，然后放置于4℃冰箱冷藏室萃取48 h。類胡蘿卜素萃取，稱取0.50 g粉末，用V（丙酮）∶V（石油醚）=1∶1提取，定容至20.0 mL，提取條件同葉綠素萃取。花青苷的萃取參照Li[8]的方法，稱取1.00 g粉末，用體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇鹽酸（97.0 mL甲醇+3.0 mL體積分?jǐn)?shù)為36%的鹽酸）萃取，定容至25.0 mL，完全遮光后放置在4℃冰箱冷藏室中萃取24 h，將上清轉(zhuǎn)入新的容器中4℃遮光保存，再向殘?jiān)屑尤?5.0 mL甲醇鹽酸，相同條件下萃取12 h，重復(fù)該操作2次，將3次萃取液的上清合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用甲醇鹽酸定容至25.0 mL。花青苷萃取液的水解參照辛轉(zhuǎn)霞[9]的方法并加以改進(jìn)，吸取600.0 μL甲醇鹽酸萃取液與750.0 μL的2.0 mol·L-1鹽酸混勻，恒溫（95℃）加熱45 min。加熱后迅速冰上冷卻，加入370.0 μL異戊醇劇烈震蕩混勻，4℃下6 000 r min-1離心5 min，待混合液分層后，將上相移至新的離心管中用于檢測。其他類黃酮的萃取參照Li[8]的方法，稱取1.00 g粉末，用25.0 mL甲醇溶液超聲提取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后并定容至25.0 mL。

1.3.3 紫外分光光度計(jì)檢測用紫外可見分光光度計(jì)分別檢測上述萃取液的吸收峰及吸光度，波長范圍為200～700 nm。葉綠素和類胡蘿卜素的含量測定以文獻(xiàn)[4]中的方法作為參考；總黃酮的含量測定采用中國藥典[10]所記載的方法：用蘆丁（rutin）為樣品，制備梯度標(biāo)準(zhǔn)液，510 nm波長下測定吸光度值，得到質(zhì)量濃度（c）與吸光度D（λ）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后以紫葉李甲醇萃取液為樣相同條件重復(fù)測定3次。紫葉李葉片總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·g-1）測定的公式為M=10×c×V1/（m×0.2）。c為上述方法求得的總黃酮質(zhì)量濃度（g·L-1）；m為樣品干質(zhì)量（g）；V1為樣品定容體積（mL）；0.2為待測萃取液的所用量（mL）；10為測定液終定容體積（mL）[11]。花青苷水解液的檢測，還需向萃取液中加入200.0 μL體積分?jǐn)?shù)為5%氯化鋁甲醇溶液后再次檢測吸收峰[12]。

1.3.4 薄層層析色譜法（TLC）鑒定色素色素分離用玻璃毛細(xì)管虹吸待測萃取液和色素標(biāo)樣，點(diǎn)滴到纖維素層析板上，放入層析槽用不同的流動相進(jìn)行色譜分離。該試驗(yàn)所用流動相為以下5種：Forestal溶液[V（濃鹽酸）∶V（冰乙酸）∶V（水）=3∶30∶10]；BAW溶液[V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）=6∶1∶2]；30% HoAc溶液[V（冰乙酸）∶V（水）=3∶7]；Formic溶液[V（濃鹽酸）∶V（甲酸）∶V（水）=2∶5∶3]；BuHCL溶液[V（正丁醇）∶V（2 mol·L-1鹽酸）=1∶1]。萃取液各成分分離后，測定顯色色斑在色譜上的Rf值，即色斑中心距原點(diǎn)的距離與溶劑展開前沿距原點(diǎn)距離的比值[13-14]。色素鑒定：多種類黃酮呈無色或淡黃色，很難用肉眼觀察到。在本試驗(yàn)中，首先在正常光照條件下，測量顯色色斑的Rf值，通過與標(biāo)樣對照確定化合物種類，然后將層析后的纖維素板用紫外光照射，觀察類黃酮的顏色變化，通過對比標(biāo)樣并參考李玲等[15]的方法進(jìn)行鑒定。將檢測到的顯色斑點(diǎn)用刀片輕輕刮下，用1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇鹽酸溶液萃取，靜置6 h后于14 000 r·min-1下離心1 min，將上清液用0.22 μm的濾膜過濾，置于4℃冰箱保存待用[8]。1.3.5高效液相色譜-二極管陣列檢測法（HPLC-DAD）檢測本研究所用高效液相色譜儀（L-2000）選用L-2455型二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。儀器參數(shù)：C18柱，柱溫40℃，進(jìn)樣量10.0 μL，流速0.50 mL· min-1，檢測波長為280 nm，520 nm，535 nm，540 nm。流動相參數(shù)：A為體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸水溶液，B為色譜級乙腈。梯度洗脫程序?yàn)椋?～40 min，A 95%～0，B 5%～100%；40～60 min，A 0，B 100%[9]。檢測結(jié)束后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算葉片中各單體酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·kg-1）。

1.3.6 pH值測定參照并改進(jìn)周文彬等[16]的方法對紫葉李葉片細(xì)胞液的pH值進(jìn)行測定，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外可見分光光度計(jì)檢測

圖1 紫葉李葉片類黃酮萃取液紫外圖譜Figure 1 UV spectrum of the pigment extracts of Prunus cerasifera leaves

類胡蘿卜素的吸收峰位于400～500 nm[8]。紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果表明，紫葉李葉片的類胡蘿卜素萃取液在這個區(qū)間內(nèi)有2個吸收峰（圖1A，峰1和峰2），表明葉片中含有類胡蘿卜素（圖1A，峰2），根據(jù)類胡蘿卜素定量方法計(jì)算得到類胡蘿卜為0.76 mg·g-1。葉綠素的吸收峰區(qū)間為600～700 nm[7]。紫葉李葉片的葉綠素萃取液在662 nm處檢測到吸收峰（圖1B，峰3），這與葉綠素a的特征吸收峰（663 nm）相符，表明紫葉李葉片中有葉綠素的存在，且葉綠素a較多。根據(jù)葉綠素定量方法計(jì)算得到葉綠素a為1.69 mg·g-1，葉綠素b為1.06 mg·g-1，葉綠素總為2.74 mg·g-1。花青苷萃取液的紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果表明：在283 nm（圖1D，峰7）和533 nm（圖1D，峰8）處有2個特征吸收峰，這2個峰均位于類黃酮化合物的特征吸收峰區(qū)間內(nèi)（280 nm附近和500～550 nm），說明紫葉李葉片內(nèi)含有黃酮類化合物[17]。將紫葉李葉片水解液也進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測。結(jié)果顯示：紫葉李葉片水解液在283 nm（圖1E，峰9）和536 nm（圖1E，峰10）處有吸收高峰，說明可能存在花青素類的矢車菊素和飛燕草素[18]。向上述水解液中加入體積分?jǐn)?shù)為5%氯化鋁后，可見光區(qū)的最大吸收峰波長由533 nm移動到535 nm，說明紫葉李葉片中所含花青苷可能是矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素中的一種或多種[12]。類黃酮化合物除了花青苷/素之外，還包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇等[19]。對甲醇萃取液在200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示：在270 nm（圖1C，峰4），290 nm（圖1C，峰5）和369 nm（圖1C，峰6）處有吸收峰，說明紫葉李葉片中可能含有二氫黃酮醇、黃酮醇和黃烷酮類物質(zhì)[20]。根據(jù)總黃酮測定方法，得到標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的吸光度D（λ）與標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（c）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：c=0.537 8 D（λ）-0.008，R2=0.999 9，計(jì)算得到紫葉李葉片甲醇萃取液中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.68 mg·g-1。據(jù)此初步推測，紫葉李葉片呈現(xiàn)紅色的主要原因可能是花青素大量積累的結(jié)果，同時也伴有其他黃酮類化合物的存在。

2.2 薄層層析色譜檢測

將紫葉李水解萃取液在5種流動相中展開，觀察到薄層板上均有1個紅色斑點(diǎn)（圖2），其對應(yīng)Rf值如表1所示。與矢車菊素和矢車菊素半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值對比發(fā)現(xiàn)，紫葉李葉片中主要的花青素種類可能為矢車菊素半乳糖苷及其他矢車菊素衍生物。

圖2 不同流動相中花青苷萃取液薄層層析色譜圖Figure 2 Thin layer chromatogram in the five different mobiles phase

表1 紫葉李葉片花青苷萃取液在5種流動相中的Rf值Table 1 Rfvalues of anthocyanin extracts of Prunus cerasifera leaves in five mobile phase

2.3 高效液相色譜檢測

將經(jīng)薄層層析分析后刮板并重復(fù)萃取的紫葉李葉片花青苷水解液用HPLC-DAD進(jìn)行檢測，在22.09，24.38，25.05 min處檢測到3個吸收峰，這與標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素的出峰時間基本一致，推斷萃取液中有矢車菊素、矮牽牛素和天竺葵素（圖3，峰1～3）的存在。確定母體色素后，進(jìn)而檢測其自然狀態(tài)下花青苷的組成，在18.50，19.30，19.72 min處檢測到吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素半乳糖苷、蕓香苷、阿拉伯糖苷的出峰時間基本一致，推斷為矢車菊素半乳糖苷、蕓香苷、阿拉伯糖苷（圖4，峰4～6），其中大部分是矢車菊素的衍生物，還有少量糖苷和矮牽牛素及天竺葵素結(jié)合成花青苷。除花青苷外，還有其他類黃酮化合物在紫葉李葉片成色過程中起輔助作用，甲醇萃取液檢測到10種我們已鑒定出的類黃酮（圖5，峰7～16），其保留時間依次為26.89，30.90，31.62，32.01，33.53，34.44，38.02，39.32，44.97，46.55 min，與標(biāo)準(zhǔn)品表兒茶素、二氫楊梅酮、蘆丁、對香豆酸、香豆酸、二氫槲皮素、根皮苷、楊梅素、槲皮素、芹菜素的保留時間是相同的，推斷萃取液中存在這10種化合物。根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程對這些化合物進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表2所示。圖5中出現(xiàn)的s1和s2等2個吸收峰尚未鑒定出其對應(yīng)的化合物種類，還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定分析。單體酚標(biāo)準(zhǔn)樣品液相圖譜見圖6。

圖3 紫葉李葉片水解萃取液液相圖譜Figure 3 HPLC chromatogram of Prunus cerasifera leaves hydrolysis extracts

圖4 紫葉李葉片薄層層析萃取液液相圖譜Figure 4 HPLC chromatogram of TLC about Prunus cerasifera leaves anthocyanin extracts

圖5 紫葉李甲醇萃取液液相圖譜Figure 5 HPLC chromatogram of Prunus cerasifera leaves flavonoids extracts

圖6 單體酚標(biāo)準(zhǔn)樣品液相圖譜Figure 6 HPLC chromatogram of monomeric phenols standard samples

3 結(jié)論與討論

紫葉李初春芽為紅色，展葉后顏色逐漸加深，盛夏滿株嬌艷紫紅，是園林綠化樹種中紅色葉保持時間最為持久的樹種之一。植物葉片所含主要成色色素有葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和甜菜堿色素等[21]。到目前為止，甜菜堿色素只在少數(shù)幾種植物中分離得到，并且尚未發(fā)現(xiàn)其與花青苷同時存在于同一植物細(xì)胞組織中。在對紫葉李葉片的不同萃取液進(jìn)行分析時，均未檢測到甜菜堿色素的特征吸收峰，據(jù)此推斷，紫葉李葉片中不存在有甜菜堿類色素。通過高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器對紫葉李葉片的甲醇鹽酸萃取液及水解液進(jìn)行分析，檢測到矢車菊素與矢車菊素半乳糖苷同時存在于萃取液中，數(shù)據(jù)顯示，矢車菊素半乳糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4 600.00±11.50 mg·kg-1）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于矢車菊素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（168.00±0.34 mg·kg-1），而薄層層析分析中只觀察到1個斑點(diǎn)（矢車菊素半乳糖苷），可能是因?yàn)樽先~李中花青苷多以矢車菊素衍生物的形式存在，而矢車菊素太少導(dǎo)致無法在層析板上觀察到。此外，除含有矢車菊素半乳糖苷和矢車菊素外，紫葉李葉片中還含有少量的矮牽牛素和天竺葵素?；ㄇ嘬疹惿厥羌t色葉植物成色的主要色素，但其他黃色或無色色素也起著重要作用，在它們的輔助下，植物葉片才呈現(xiàn)出飽滿的色彩[22]。在植物中，花青苷和葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比會影響其所在器官顏色的呈現(xiàn)[23]，因此，紫葉李中兩者的存在及相對含量對其葉片顏色的加深有很大影響。經(jīng)檢測，紫葉李葉片細(xì)胞液的pH 5.20，通常來說，偏酸性（pH 5.00～5.50）環(huán)境下矢車菊素半乳糖苷的顏色為亮紅色[24]，而紫葉李成熟葉片的顏色為紫紅色，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是葉綠素（2 744.00 mg·kg-1）與矢車菊素半乳糖苷（4 600.00 mg·kg-1）的共同存在與相互作用。紫葉李葉片中還含有槲皮素、楊梅素、蘆丁、芹菜素、二氫楊梅素、二氫槲皮素、表兒茶素、根皮苷、類胡蘿卜素等物質(zhì)，它們作為輔助色素對紫葉李葉色的形成也起著一定的作用。

表2 紫葉李葉片內(nèi)各單體酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 The monomeric phenol contents in Prunus cerasifera leaves

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Chromogenic pigments in Prunus cerasifera leaves

GAO Yan,LI Houhua,LI Ling,WANG Yajie,XU Man
（College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shannxi,China）

Prunus cerasifera,the most common foliage tree on the landscape,have purple leaves throughout their growing season.To provide a theoretical basis for cultivar improvement and to determine their role in breeding,pigments ofP.cerasiferaleaves were qualitatively identified using high performance liquid chromatography（HPLC）,thin layer chromatography,and UV photo-spectrometer；and then quantitatively analyzed with HPLC-Diode array detector（DAD）.Results demonstrated that the main chromogenic pigments inP.cerasiferaleaves were carotenoids,chlorophyll（mainly chlorophyll a）,cyanidin,petunidin,cyanidingalactoside,pelargonidin,and other monomeric phenols（quercetin,rutin,and dihydromyricetin）.Accumulation of cyanidin-galactoside and cyanidin caused the red coloration；and chlorophyll,carotenoids,quercetin,and rutin played an important role as co-pigments.Pigments and the coloring mechanism of leaves could provide a theoretical basis for cultivar improvement and could play an important role inP.cerasiferabreeding.[Ch,6 fig. 2 tab.24 ref.]

botany；Prunus cerasifera；pigment；coloring mechanism；cyanidin-galactoside

S718.43；S687.9

A

2095-0756（2014）03-0481-07

2013-09-22；

2013-11-18

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204308）；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（QN2013079）

高艷，從事園林植物類黃酮次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控研究。E-mail：gaoyanyan.gy@163.com。通信作者：李厚華，副教授，博士，從事植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、植物花色調(diào)控等研究。E-mail：lihouhua73@163.com