張 霞,付海霞,鄭亞莉*

(1寧夏人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,銀川 750002；2山東日照市中心醫(yī)院血液凈化中心,日照 276800)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)屬于老年退行性疾病,嚴(yán)重影響著人類的身體健康。細(xì)胞周期素依賴性激酶5(cyclin dependent kinase 5,Cdk5)作為Cdk家族成員,在病理情況下,由于p35裂解為p25,而被過度激活[1]。過度活化的Cdk5在神經(jīng)系統(tǒng)可導(dǎo)致Tau蛋白過度磷酸化,引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進展[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),胰島細(xì)胞中存在p35,高糖刺激可使p35表達增高,使Cdk5過度激活、抑制胰島素分泌,而抑制該激酶活性可能發(fā)揮治療T2DM作用[2]。前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),由p35分解得到的短肽Cdk5抑制肽(Cdk5 inhibitory peptide,CIP)可抑制Cdk5活性,可能用于治療神經(jīng)退行性疾病[3]。有研究發(fā)現(xiàn),T2DM與神經(jīng)退行性疾病發(fā)病有著共同的病理生理機制[2,4]。本研究中,繼續(xù)分解CIP得到24個氨基酸的短肽p5,連接TAT蛋白和FITC后合成TFP5,探究TFP5對高糖刺激下胰島細(xì)胞中Cdk5活性、胰島細(xì)胞存活和功能的影響,探討其對T2DM的防治作用。

1 材料與方法

1.1 抗體和試劑

Cdk5、p35抗體購自Santa Cruz生物公司,微管蛋白(tubulin)單克隆抗體、Bax、Bcl-2抗體和Lipofectamine基因轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司,DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司,胎牛血清購自Hyclone公司,胰島素分泌測定酶標(biāo)免疫試劑盒購自Linco Research公司。小鼠胰島β細(xì)胞(Min6細(xì)胞株),由NIH,Dr.Abner Notkins’Lab贈送。TFP5肽由21st Century Biochemicals(Marlboro,MA)合成。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及刺激

Min6細(xì)胞在含有4.5g/L的葡萄糖、10%的胎牛血清、100kU/L的青霉素G和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。胰島細(xì)胞鋪板于6孔培養(yǎng)盤(100萬/孔)。次日分別用不同濃度的葡萄糖(5,25mmol/L)培養(yǎng)刺激,并將高糖條件下培養(yǎng)的細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EV、TFP5和攜帶p5基因的病毒(1ml/L),48h后收取細(xì)胞和上清液。裂解細(xì)胞,收取蛋白做各種蛋白表達及Cdk5酶活性測定。用ELISA試劑盒檢測上清液中胰島素的分泌量。

1.3 Cdk5激酶活性測定

用細(xì)胞裂解液收取細(xì)胞,提取蛋白,BCA法進行蛋白定量分析(Biorad protein assay)。取200μg蛋白加Cdk5多克隆抗體,在4℃中旋轉(zhuǎn)孵育過夜,次日加免疫球蛋白A瓊脂糖凝膠珠在4℃中旋轉(zhuǎn)孵育4h,用細(xì)胞溶解液洗3次,得到Cdk5激酶,用同位素γ-32P標(biāo)記測定酶的活性。

1.4 免疫印跡(Western blot)

裂解細(xì)胞提取蛋白與上樣緩沖液混合后,按每道35μg上樣到4%～20% SDS-PAGE凝膠,電泳分離,轉(zhuǎn)膜到PVDF膜(100V,90min)。用封閉液封閉1h,加入一抗反應(yīng)液(以5%脫脂奶粉封閉液稀釋抗Cdk5和p35多克隆抗體,1∶200),4℃孵育過夜,TBST溶液漂洗4次,與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)在室溫下孵育1～2h,再以TBST溶液漂洗4次,ECL顯色,X線底片曝光。

1.5 胰島素分泌水平測定

將Min6細(xì)胞鋪板到6孔培養(yǎng)盤(100萬/孔),在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),其中加10%胎牛血清,和100kU/L的青、鏈霉素。放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加TFP5或帶有p5基因的腺病毒(濃度1mg/L每孔)。48h后收取細(xì)胞和上清液,裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白進行體外激酶活性實驗測定Cdk5活性變化；用胰島素ELISA試劑盒分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中胰島素的分泌水平,用免疫酶標(biāo)的方法進行測定分析。

1.6 免疫熒光染色

細(xì)胞用4%甲醛固定30min,5% BSA/PBS(含0.1% TritonX-100)封閉液封閉30min,加入用封閉液稀釋的一抗,4℃孵育過夜或室溫下孵育2h。加入免疫熒光標(biāo)記的IgG抗體(二抗)在室溫下孵育1h,然后用PBS洗滌3遍,細(xì)胞核用Hoescht33342染色。熒光圖像使用Zeiss LSM-510掃描共聚焦顯微鏡,圖像處理使用Adobe Photoshop。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TFP5來源及基因序列

將p35的C端24個氨基酸序列(Lys254-Ala277)短肽分解出來,命名為p5(圖1A)；在p5短肽-C端連接一具有11個氨基酸的TAT蛋白(一種細(xì)胞穿透肽),N端連接FITC(一種綠色熒光蛋白)合成TFP5(圖1B)。

圖1 TFP5結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 The schematic diagram of TPF5

2.2 TFP5可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并在Min6細(xì)胞表達

將TFP5肽導(dǎo)入Min6細(xì)胞(100nmol/L),以腺病毒-p5和空病毒載體為對照,以抗p35抗體為一抗,用Western印跡法檢測p5蛋白表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組Min6細(xì)胞均有p35蛋白表達,導(dǎo)入TFP5和腺病毒-p5后,可檢測到Min6細(xì)胞表達p5蛋白(圖2A)。

免疫熒光鏡下顯示導(dǎo)入TFP5肽后Min6細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光,也證實TFP5可有效進入細(xì)胞內(nèi)(圖2B)。

圖2 TFP5轉(zhuǎn)染Min6細(xì)胞后表達檢測Figure 2 The expression of TFP5 in Min6 cells

2.3 TFP5抑制高糖刺激下Cdk5過度活性、恢復(fù)胰島素分泌

實驗分3組。1組：低糖組(5mmol/L)；2組：高糖(25mmol/L)+空病毒載體(EV)組；3組：高糖(25mmol/L)+TFP5組。提取3組細(xì)胞中的蛋白檢測Cdk5活性,組蛋白H1為底物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下組蛋白H1磷酸化水平升高,Cdk5活性增高(圖3A、3B,2組vs1組)；導(dǎo)入TFP5后組蛋白H1磷酸化水平下降,Cdk5活性降低(圖3A、3B,3組vs2組)。

收集3組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,ELISA方法檢測上清中胰島素分泌水平,發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下胰島素分泌減少(圖3C,2組vs1組),轉(zhuǎn)染TFP5后,可恢復(fù)Min6細(xì)胞的胰島素分泌(圖3C,3組vs2組)。

2.4 TFP5抑制高糖刺激下Min6細(xì)胞凋亡

以TFP5或空病毒載體(EV)轉(zhuǎn)染Min6細(xì)胞,24h后給予高糖或低糖刺激。試驗共分4組：TFP5+低糖刺激組(5mmol/L)、TFP5+高糖刺激組(25mmol/L)、EV+低糖刺激組(5mmol/L)、EV+高糖刺激組(25mmol/L)。作用24h后收集細(xì)胞提取蛋白,采用Western印跡法分析細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Bax和Bcl-2蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)低糖刺激,TFP5不影響細(xì)胞凋亡；高糖刺激可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)染TFP5后細(xì)胞凋亡明顯減少(圖4)。

3 討 論

T2DM的病理生理基礎(chǔ)是胰腺β細(xì)胞損害和凋亡,發(fā)病率、病死率越來越高,嚴(yán)重威脅人類健康[5]。Cdk5是Cdk家族的成員,是脯氨酸限制性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,普遍存在于哺乳動物的細(xì)胞內(nèi)[1]。生理情況下,Cdk5與其激活亞基p35結(jié)合形成Cdk5/p35復(fù)合物而被激活,參與一系列生理過程。而在病理狀態(tài)下,如氧化應(yīng)激、高血糖等環(huán)境下,p35分解為p25與Cdk5結(jié)合形成Cdk5/p25復(fù)合物,使Cdk5處于過度激活狀態(tài),便某些底物過磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

在阿爾茨海默病中,Cdk5與p25結(jié)合后過磷酸化tau蛋白導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3]。許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T2DM與阿爾茨海默病在發(fā)生發(fā)展過程中有相似的病理生理機制參與[6-9]。近來有研究發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞中表達Cdk5和p35,Cdk5過度激活參與了T2DM的發(fā)病,提示Cdk5激酶抑制劑可能用于治療T2DM。

Cdk5激酶化學(xué)抑制劑大部分競爭性地結(jié)合ATP結(jié)合位點,缺乏特異性,且有嚴(yán)重不良反應(yīng)無法應(yīng)用于臨床。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn),將P35蛋白分解得到短肽CIP(含125個氨基酸殘基)可特異性地抑制Cdk5激酶活性[3,10],進一步分解得到24個氨基酸殘基的短肽p5仍可特異性地抑制Cdk5激酶活性,甚至作用優(yōu)于CIP[3]。但在p5臨床應(yīng)用的研究過程中,面臨的一個重要的問題是基因載體的選擇。目前常用的載體有質(zhì)粒載體和病毒載體,前者安全性高,但對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率低,影響療效,后者對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率高,但有潛在致癌性,而且病毒蛋白易引起免疫反應(yīng),在治療安全性上存在問題。本實驗通過連接FITC和TAT,用基因重組技術(shù)合成得到含p5肽、TAT并標(biāo)記了綠色熒光的TFP5短肽。TAT是一個具有細(xì)胞穿透能力的短肽,可作為一個安全而又細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高的載體。以TAT蛋白為載體,能否高效進入細(xì)胞內(nèi)？本實驗第二部分,觀察了TFP5導(dǎo)入Min6的效果,發(fā)現(xiàn)TFP5進入細(xì)胞率高達90%(圖2B)。那么,在胰島β細(xì)胞中,TFP5是否具有抑制Cdk5活性的作用,進而能否調(diào)節(jié)胰島素的分泌？本試驗第三部分,用高糖刺激細(xì)胞誘發(fā)Min6細(xì)胞中Cdk5過度活性,并加入TFP5,觀察Cdk5激酶活性變化和細(xì)胞胰島素分泌水平。結(jié)果證實,高糖刺激可以誘發(fā)Cdk5高活性,抑制胰島素分泌,TFP5能有效地抑制Cdk5高活性,恢復(fù)胰島素分泌水平。以上的結(jié)果是否是通過抑制了高糖對胰島β細(xì)胞的損傷而起作用？本試驗第四部分,比較了高糖刺激下,加入TFP5后Min6細(xì)胞表達Bax/Bcl-2比例水平變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFP5可抑制高糖刺激下胰島細(xì)胞的異常凋亡。

圖3 TFP5對Min6細(xì)胞中Cdk5活性和胰島素分泌的影響Figure 3 The effect of TFP5 on Cdk5 activity and insulin secretion

圖4 TFP5對高糖刺激下Min6細(xì)胞凋亡的作用Figure 4 The effect of TFP5 on apoptosis of Min6 cells treated with high glucose

綜上所述,TFP5作為Cdk5激酶過度活性的抑制短肽,不需要載體可直接進入細(xì)胞內(nèi),抑制高糖誘導(dǎo)的Cdk5過度活性,減輕胰島細(xì)胞凋亡,恢復(fù)高糖環(huán)境下胰島細(xì)胞對胰島素的分泌,可能成為靶向Cdk5激酶治療T2DM病的新途徑。

【參考文獻】

[1]Hisanaga S,Saito T.The regulation of cyclin-dependent kinase 5 activity through the metabolism of p35 or p39 Cdk5 activator[J].Neurosignals,2003,12(4-5):221-229.

[2]Zheng YL,Hu YF,Zhang A,et al.Overexpression of p35 in Min6 pancreatic beta cells induces a stressed neuron-like apoptosis[J].J Neurol Sci,2010,299(1-2):101-107.

[3]Dhavan R,Tsai LH.A decade of CDK5[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(10):749-759.

[4]Zheng YL,Kesavapany S,Gravell M,et al.A Cdk5 inhibitory peptide reduces tau hyperphosphorylation and apoptosis in neurons[J].EMBO J,2005,24(1):209-220.

[5]Andrali SS,Sampley ML,Vanderford NL,et al.Glucose regulation of insulin gene expression in pancreatic beta-cells[J].Biochem J,2008,415(1):1-10.

[6]Wei FY,Tomizawa K.Cyclin-dependent kinase 5(Cdk5):a potential therapeutic target for the treatment of neurodegenerative diseases and diabetes mellitus[J].Mini Rev Med Chem,2007,7(10):1070-1074.

[7]Zhao WQ,Townsend M.Insulin resistance and amyloidogenesis as common molecular foundation for type 2 diabetes and Alzheimer's disease[J].Biochim Biophys Acta,2009,1792(5):482-496.

[8]Haan MN.Therapy insight:type 2 diabetes mellitus and the risk of late-onset Alzheimer's disease[J].Nat Clin Pract Neurol,2006,2(3):159-166.

[9]Li L,Holscher C.Common pathological processes in Alzheimer disease and type 2 diabetes:a review[J].Brain Res Rev,2007,56(2):384-402.

[10]Zheng YL,Li C,Hu YF,et al.Cdk5 inhibitory peptide(CIP)inhibits Cdk5/p25 activity induced by high glucose in pancreatic beta cells and recovers insulin secretion from p25 damage[J].PLoS One,2013,8(9):e63332.