烏日娜，劉 翔，郭邦成，閆立群，張玉平

(1.北方民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021;2.寧夏自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750004)

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM，單增李斯特菌)是一種重要的極具威脅的食源性病原菌。該菌在環(huán)境中無(wú)處不在，主要通過(guò)食物傳播［1］。肉類(lèi)、蛋類(lèi)、禽類(lèi)、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源，很多國(guó)家都已經(jīng)采取措施來(lái)控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。李斯特菌病是經(jīng)進(jìn)食被單增李斯特菌污染的食物而引起的一種嚴(yán)重的食源性疾病，易感人群包括老年人、孕婦、新生兒和免疫功能障礙者，該病的致死率高達(dá)30% ～70%［2］。國(guó)內(nèi)外各地食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，食品中單增李斯特菌的污染普遍存在，受污染的食物種類(lèi)繁多，涉及生肉類(lèi)、動(dòng)物水產(chǎn)品、熟肉制品、速凍米面食品、蔬菜等食品，極有可能導(dǎo)致李斯特菌病和構(gòu)成潛在流行的威脅［3］。鑒于此，積極進(jìn)行全國(guó)范圍內(nèi)食品中單增李斯特菌的污染狀況研究十分必要。不同地區(qū)使用抗生素種類(lèi)不同，導(dǎo)致了當(dāng)?shù)刂虏【哪退幏N類(lèi)和特性也必然不同。研究各地區(qū)食品中單增李斯特菌的耐藥特性，對(duì)于李斯特菌病的預(yù)防和治療意義重大。目前，對(duì)于寧夏銀川市食源性單增李斯特菌的耐藥情況還尚未見(jiàn)研究報(bào)道，筆者對(duì)銀川市市售食品中單增李斯特菌的污染情況、血清型和抗生素敏感性進(jìn)行分析，以期能為預(yù)防控制食源性單增李斯特菌的爆發(fā)流行、追蹤溯源和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源。2012年10月至2013年9月期間在銀川市3個(gè)區(qū)(金鳳區(qū)、西夏區(qū)和興慶區(qū))的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市進(jìn)行取樣，每個(gè)區(qū)選取2家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和1家超市，其中每個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)選取2個(gè)攤位。嚴(yán)格按照取樣計(jì)劃，每月采集樣品60份，樣品共計(jì)720份，包括生羊肉(145份)、生牛肉(145份)、生豬肉(120份)、生雞肉(120份)、動(dòng)物性水產(chǎn)品(70份)和速凍米面制品(120份)。其中肉類(lèi)采樣包括常溫、冷鮮和冷凍貯藏樣品。

1.1.2 試驗(yàn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株:單增李斯特菌ATCC19112，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心;藥敏質(zhì)控菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希氏菌ATCC2922，由寧夏自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑與培養(yǎng)基。單增李斯特菌用LB1、LB2增菌液，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;PALCAM瓊脂基礎(chǔ)及添加劑、單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基、TSA-YE、木糖及鼠李糖發(fā)酵管、SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;MH血瓊脂平板CP0220A，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;抗生素藥敏紙片，QXOID英國(guó)公司;API Listeria生化鑒定條，生物梅里埃公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備。麥?zhǔn)媳葷醿x，法國(guó)梅里埃生物公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱，南京試驗(yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌分離鑒定方法。按照2012年《國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)工作手冊(cè)》［4］，同時(shí)參考GB4789.30-2010《單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌檢驗(yàn)》［5］進(jìn)行樣品的分離和菌株鑒定。

1.2.2 血清分型試驗(yàn)方法。按照單增李斯特菌血清使用說(shuō)明書(shū)，用單增李斯特菌血清，通過(guò)玻片凝集法(O抗原)和試管凝集法(H抗原)進(jìn)行血清分型。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)方法?？股胤N類(lèi)參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的單增李斯特菌藥敏試驗(yàn)抗生素選擇原則和臨床治療常用抗生素確定。共選擇21種抗生素:慶大霉素(CN)、亞胺培南(IMP)、氯霉素(C)、多粘菌素(PB)、頭孢噻吩(KF)、頭孢噻肟(CTX)、鏈霉素(S)、復(fù)方新諾明(SXT)、諾氟沙星(NOR)、利福平(RD)、四環(huán)素(TE)、紅霉素(E)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、強(qiáng)力霉素(DO)、氨芐西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、新生霉素(N)、青霉素(P)、呋喃妥因(F)、環(huán)丙沙星(CIP)、萬(wàn)古霉素(VA)。藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)按照NCCLs手冊(cè)2005版。藥敏試驗(yàn)采用世界衛(wèi)生組織(WHO)及美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用spss13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類(lèi)食品中單增李斯特菌的污染情況 銀川市各類(lèi)食品中單增李斯特菌污染情況見(jiàn)表1。由表1可知，720份食品中檢出單增李斯45株，總檢出率為6.25%，其中污染率最高的是生雞肉(8.33%)，其次為生豬肉和速凍米面制品(7.50%)，之后依次為動(dòng)物性水產(chǎn)品(5.71%)、生牛肉(4.83%)和生羊肉(3.45%)。不同食品中單增李斯特菌檢出率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 不同季度食品中單增李斯特菌的污染情況比較 對(duì)4個(gè)季度食品中單增李斯特菌的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體情況見(jiàn)表2。4個(gè)季度中第3季度檢出率最高，為13.89%;其次為第2季度，檢出率為6.67%;第4季度檢出率最低，為0.56%。各季度單增李斯特菌檢出率有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各類(lèi)食品中單增李斯特菌的檢出率

表2 各季度食品中單增李斯特菌的檢出率

2.3 不同貯藏溫度食品中單增李斯特菌的檢出情況 除了速凍米面制品外，所檢測(cè)的生肉類(lèi)和動(dòng)物性水產(chǎn)品共計(jì)600份樣品，均包括常溫、冷鮮和冷凍貯藏樣品。常溫樣品反映了當(dāng)?shù)貙?shí)際氣候的溫度，冷鮮肉溫度控制在-4℃。生豬肉沒(méi)有采集冷凍樣品，動(dòng)物性水產(chǎn)品均為冷鮮或冷凍貯藏。結(jié)果表明，3種貯藏溫度中冷鮮樣品中單增李斯特菌檢出率最高，為10.77%，冷凍次之(5.56%)，常溫肉品檢出率最低(3.50%)，不同儲(chǔ)存條件有顯著性差異(P＜0.05)。從具體的食品種類(lèi)來(lái)看，各類(lèi)食品在不同貯藏溫度下單增李斯特菌的污染情況不同，具體見(jiàn)表3。

表3 不同貯藏溫度各類(lèi)食品中單增李斯特菌的檢出率

由表3可知，對(duì)于生牛肉和生羊肉樣品，常溫和冷鮮均未檢出單增李斯特菌，僅冷凍樣品有，檢出率均為7.06%，且二者在所有冷凍樣品中單增李斯特菌的檢出率較高。冷鮮肉品中冷鮮雞肉單增李斯特菌檢出率最高(25.00%)，動(dòng)物性水產(chǎn)品和生豬肉的檢出率均為10.00%。常溫樣品中生豬肉檢出率最高(6.25%)，其次是生雞肉(5.00%)。

2.4 超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)食品中單增李斯特菌的檢出情況比較 農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集生肉樣共計(jì)270份，檢出單增李斯特菌的陽(yáng)性樣本有10個(gè)，檢出率為3.70%;超市采集生肉樣330份，檢出單增李斯特菌26個(gè)，檢出率達(dá)7.88%。不同來(lái)源市售肉品中單增李斯特菌的檢出率有顯著性差異(P＜0.05，χ2=4.590，P=0.032)。

2.5 單增李斯特菌血清學(xué)分型結(jié)果 45株食源性單增李斯特菌共分為5 個(gè)血清型(1/2a、1/2b、1/2c、4b 和 4a)，1/2a 型為主要血清型，占 46.67%(21/45);其次為 1/2c型(44.44%，20/45)、1/2b(2.22%，1/45)、4b(2.22%，1/45)、4a(4.44%，2/45)。5種血清型中1/2a型分布最廣，在所有種類(lèi)樣品中均有檢出，1/2c型僅在熟肉制品中未檢出，致病性較強(qiáng)的4b型分離自生雞肉中，1株1/2b型分離自速凍米面制品。

2.6 單增李斯特菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 45株單增李斯特菌進(jìn)行21種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，有37株單增李斯特菌對(duì)7種抗生素存在耐藥，總耐藥率為82.22%(37/45)，其中耐多粘菌素就有35個(gè)，耐藥率為77.78%(35/45)，其次是頭孢噻肟、四環(huán)素、呋喃妥因、青霉素、紅霉素和頭孢噻吩，耐藥率分別為 28.89%(13/45)、13.33%(6/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)、4.44%(2/45)和 2.22%(1/45);鏈霉素、強(qiáng)力霉素和氯霉素藥敏處于中介，中介率分別為11.11%(5/45)、6.67%(3/45)和4.44%(2/45)。對(duì)諾氟沙星、利福平、氨芐西林/舒巴坦、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、氨芐西林、左氧氟沙星、慶大霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素和亞胺培南全部敏感。37株耐藥菌株中，單一耐藥的菌株有18株，其中耐多粘菌素有16株，雙重耐藥10株，三重耐藥8株，四重耐藥1株。

3 討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究人員紛紛對(duì)不同食品中的單增李斯特菌污染狀況進(jìn)行了研究。全球各地食品中均有不同程度的單增李斯特菌污染，其中生肉中單增李斯特菌的污染情況最嚴(yán)重［6-13］。該研究結(jié)果顯示，生雞肉中單增李斯特菌檢出率最高，為8.33%;其次是生豬肉和速凍米面制品;動(dòng)物性水產(chǎn)品、生牛肉和生羊肉中檢出率較低。這提示生肉類(lèi)是該地區(qū)重點(diǎn)食品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)種類(lèi)，尤其是雞肉、豬肉和速凍米面制品。生牛肉和生牛羊肉中單增李斯特菌的污染情況最輕，檢出率比一些研究報(bào)道均低［14-15］，其原因除了寧夏清真牛羊肉衛(wèi)生質(zhì)量管理因素之外，還與清真牛羊肉獨(dú)特的屠宰加工方式有一定關(guān)系。

該研究對(duì)4個(gè)季度食品中單增李斯特菌污染結(jié)果分析可知，污染情況最嚴(yán)重的是第3季度，該季度也是一年中溫度最高的季度，接近單增李斯特菌的最適生長(zhǎng)溫度，一旦食品被其污染大量繁殖后，出現(xiàn)食品間交叉污染的幾率更大，故檢出率最高。低溫對(duì)許多致病菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，但單增李斯特菌卻可耐受低溫，低溫環(huán)境下可以生長(zhǎng)，故在溫度較低的第1季度和第4季度仍可檢出單增李斯特菌。

該研究對(duì)不同貯藏溫度下生肉中單增李斯特菌污染情況做了調(diào)查，冷鮮肉品中單增李斯特菌檢出率最高，為10.77%，冷凍次之(5.56%)，常溫肉品檢出率最低(3.50%)。其中常溫生牛肉和生羊肉未檢出單增李斯特菌。結(jié)果表明，最令人們放心的冷鮮肉單增李斯特菌的污染程度最高，其衛(wèi)生安全很不樂(lè)觀，同時(shí)傳統(tǒng)意義上較為安全的冷凍肉中單增李斯特菌的污染程度也較高，這是因?yàn)榇酥虏【鷮?duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性，使得冷凍食品在冰箱中交叉污染的機(jī)會(huì)增加，提醒人們購(gòu)買(mǎi)冷凍食品應(yīng)充分加熱后再食用。該研究發(fā)現(xiàn)，雖然在常溫和冷鮮生牛羊肉中未檢出單增李斯特菌，但冷凍牛羊肉制品如冷凍牛羊肉卷、牛羊肉片的單增李斯特菌檢出率卻較高，其原因可能是在冷凍牛羊肉制品生產(chǎn)和貯藏過(guò)程與其他食品交叉污染，或是加工設(shè)備本身帶菌造成的，提示在冷凍肉制品加工過(guò)程中及時(shí)清洗相關(guān)設(shè)備，避免交叉污染的可能性。同時(shí)也提示消費(fèi)者在涮牛羊肉或是爆炒時(shí)注意延長(zhǎng)時(shí)間，達(dá)到充分殺菌的目的。

該研究對(duì)不同來(lái)源生肉和動(dòng)物性水產(chǎn)品中單增李斯特菌的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，超市來(lái)源肉品中單增李斯特菌檢出率較高，這說(shuō)明超市肉品的衛(wèi)生質(zhì)量狀況不容樂(lè)觀，存在嚴(yán)重的安全隱患，提示相關(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)超市的衛(wèi)生管理。

銀川市45株單增李斯特菌共分為5種血清型，其中1/2a和1/2c型是主要的血清型，該結(jié)果與其他相關(guān)研究報(bào)道基本一致［16-17］。此外，對(duì)于致病力強(qiáng)的1/2b型在速凍米面制品中檢出，4b型在生雞肉中檢出，且都是耐藥菌株，1/2b型對(duì)多粘菌素耐藥，4b型對(duì)多粘菌素和頭孢噻肟雙重耐藥。提示人們應(yīng)針對(duì)相關(guān)食品進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)督和監(jiān)測(cè)工作，防止交叉污染或烹調(diào)不當(dāng)導(dǎo)致食物中毒的發(fā)生。

耐藥性試驗(yàn)結(jié)果顯示，45株單增李斯特菌有37株耐藥，耐藥率為82.22%，與我國(guó)其他地區(qū)相比，耐藥情況嚴(yán)重，遠(yuǎn)高于其他地區(qū)的水平［16-18］。所耐受的7種抗生素中，耐多粘菌素最嚴(yán)重，這也是導(dǎo)致寧夏單增李斯特菌菌株整體耐藥率與沒(méi)有檢測(cè)該抗生素的地區(qū)相比較高的主要原因。銀川市單增李斯特菌與其他地區(qū)的菌株一樣對(duì)四環(huán)素、頭孢類(lèi)抗生素和紅霉素均產(chǎn)生一定的耐藥性，但對(duì)臨床一線藥物氨基青霉素、氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)均未出現(xiàn)耐藥情況。生豬肉和生雞肉中的單增李斯特菌耐藥情況最嚴(yán)重，這與哈爾濱市［14］的情況一樣，而寧夏人民喜食的牛羊肉中單增李斯特菌的耐藥情況較為樂(lè)觀，尤其是生羊肉中單增李斯特菌的耐藥率最低，且都是單一耐藥。

該研究及國(guó)內(nèi)外單增李斯特菌的污染狀況調(diào)查報(bào)告提示人們應(yīng)高度重視該致病菌，健全食品監(jiān)測(cè)網(wǎng)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和掌握我國(guó)食源性致病菌污染程度和污染分布特點(diǎn)，積極加強(qiáng)致病菌耐藥性監(jiān)測(cè)，獲得當(dāng)?shù)鼐甑哪退幮畔?，提高食源性疾病的預(yù)警與控制能力。

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