趙祥忠，張合亮，楊曉宙

（1.齊魯工業(yè)大學 食品與生物工程學院，山東 濟南 250353；2.國家海產(chǎn)貝類工程技術研究中心，山東 威海 264200）

近年來，我國貝類的養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，貝類加工過程中產(chǎn)生了大量的下腳料，主要包括貝類煮湯、貝類裙邊、性腺和內(nèi)臟團等[1-2]。由于貝類深精加工技術滯后，導致這些富含優(yōu)質(zhì)蛋白的原料僅用于生產(chǎn)附加值較低的飼料產(chǎn)品，造成貝類資源的極大浪費[3-4]。采用微生物發(fā)酵技術，可以將這些貝類下腳料制成富含氨基酸態(tài)氮的純天然的海鮮調(diào)味配料，天然海鮮調(diào)味料具有天然海產(chǎn)貝類的特殊風味，味道鮮美，口感濃厚，可以加強食品風味，而且氨基酸態(tài)氮和多肽的含量較高[5-6]。微生物發(fā)酵法摒棄了傳統(tǒng)的人工調(diào)配合成香精香料的方法，提高了產(chǎn)品的安全性，符合現(xiàn)代人天然、綠色、健康的生活理念[7]。對這些貝類資源進行綜合開發(fā)利用，可以為人類提供理想的海洋食品及海洋藥物，可創(chuàng)造出宏觀的經(jīng)濟效益，將有助于推動我國海洋產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展[8-9]。本研究以貝類下腳料為原料，采用微生物協(xié)同發(fā)酵，以期得到新型的海鮮調(diào)味料，對海鮮下腳料深度加工利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扇貝下腳料、鮑魚下腳料：榮成愛倫灣食品有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）：齊魯工業(yè)大學微生物菌種保藏中心。

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉，均為分析純：天津廣成化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；SHP-150型恒溫培養(yǎng)箱、LQZ-211型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏儀器設備有限公司；SW-CJ-2G型雙人超凈工作臺：蘇州凈化空調(diào)設備有限公司；7230G型電子天平：上海越平科學儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Foss Kjeltrc 2300自動凱氏定氮儀：福斯（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 測定方法

粗蛋白：采用凱氏定氮法[10]。

可溶性蛋白：取不同時期的發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH值為4.5，在3 500r/min的條件下離心除去未溶解的大分子蛋白質(zhì)和菌體，測定清液中的總氮和氨基酸態(tài)氮含量，兩者之差乘以6.25即為可溶性蛋白質(zhì)含量。

氨基酸態(tài)氮：采用甲醛滴定法[4]。

1.3.2 海鮮調(diào)味料的生產(chǎn)工藝流程

貝類下腳料→粉碎→溶解→滅菌→發(fā)酵→滅菌→過濾→產(chǎn)品

工藝操作要點：

貝類下腳料用粉碎機粉碎至100目以下，加蒸餾水制成250g/L的貝類下腳料溶液，添加1.5%的葡萄糖，調(diào)節(jié)pH值為7.0，滅菌后加入5%的米曲霉和熱帶假絲酵母（1∶1，m/m）混合液，在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵72h，發(fā)酵液滅菌后過濾即為貝類海鮮調(diào)味料。

1.3.3 試驗菌株的確定

米曲霉（Aspergillus oryzae）能產(chǎn)生豐富的蛋白酶系，包括酸性、中性和堿性蛋白酶，在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸。其穩(wěn)定性高，耐溫性較好，廣泛應用于發(fā)酵工業(yè)中[11-12]。

熱帶假絲酵母（Candida utilis）可以分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶，生長過程中產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)和B族維生素，不需要加入任何生長因子即可生長[13-15]。

試驗中配制250g/L的貝類下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，分別加入5%的米曲霉、熱帶假絲酵母和復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵72h，測定發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.4 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

對影響復合菌株協(xié)同發(fā)酵的貝類下腳料質(zhì)量濃度、復合菌株接菌量、發(fā)酵液pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間進行單因素發(fā)酵研究，并對復合菌株協(xié)同發(fā)酵的條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵菌株的確定

分別進行米曲霉和熱帶假絲酵母單菌株發(fā)酵，配制質(zhì)量濃度為250g/L的貝類下腳料溶液，添加1.5%的葡萄糖，調(diào)整pH值為7.0，滅菌后接入6%的米曲霉菌株（或6%的熱帶假絲酵母），在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵80h；米曲霉和熱帶假絲酵母協(xié)同發(fā)酵條件同上，接種量為6%（米曲霉和熱帶假絲酵母比例1∶1），單菌種及復合菌種發(fā)酵結(jié)果分別見圖1～圖3。

由圖1可知，米曲霉發(fā)酵過程中，可溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮均經(jīng)歷了先增加后減少的過程。其中可溶性蛋白在16h時，含量達到最大值18.22%，之后大幅下降，發(fā)酵初始階段，蛋白會大量溶出；16h后，菌體產(chǎn)生大量的蛋白酶，分解溶液中蛋白質(zhì)，從而使可溶性蛋白含量逐漸減少。氨基酸態(tài)氮含量前期增加緩慢，在32h后氨基酸態(tài)氮含量迅速增加，到64h時氨基酸態(tài)氮含量達到最大值1.14%，之后因菌體生長仍需氨基酸，使溶液中氨基酸含量出現(xiàn)了小幅的下降。

圖1 米曲霉對可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of Aspergillus oryzae on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

圖2 熱帶假絲酵母對可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of Candida tropicalis on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

由圖2可知，熱帶假絲酵母發(fā)酵過程中，可溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮變化趨勢同米曲霉基本一致?？扇苄缘鞍自?4h時含量達到最大值20.05%，24h后可溶性蛋白含量逐漸減少。48h后氨基酸態(tài)氮含量增加迅速，到72h時氨基酸態(tài)氮含量達到最大值0.45%。

圖3 協(xié)同發(fā)酵對可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of cooperative fermentation on the content of soluble protein and amino acid nitrogen

由圖3可知，2種發(fā)酵劑按1∶1的比例復合發(fā)酵有助于貝類下腳料的降解；當發(fā)酵到16h時，發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)達到最大值21.65%，以后逐漸減低，64h后氨基酸態(tài)氮含量上升趨勢變緩，最大值出現(xiàn)在72h，為1.30%。

對比單菌株發(fā)酵和協(xié)同發(fā)酵對可溶性蛋白質(zhì)含量和氨基酸態(tài)氮含量的影響，確定采用米曲霉和熱帶假絲酵母按1∶1（m/m）比例復合后進行發(fā)酵。

2.2 微生物協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 貝類下腳料質(zhì)量濃度對氨基酸態(tài)氮含量的影響

分 別 配 制100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L和275g/L的貝類下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入6%的復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵72h（35℃條件下培養(yǎng)是為了使復合菌株快速增長，擴大菌株的數(shù)量，50℃發(fā)酵即在對數(shù)期產(chǎn)酶，酶解貝類下腳料），測定發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量，結(jié)果見圖4。

圖4 貝類下腳料質(zhì)量濃度對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of shellfish scraps concentration on amino acid nitrogen content

由圖4可知，隨貝類下腳料溶液質(zhì)量濃度的不斷增加，氨基酸態(tài)氮含量逐漸提高，當質(zhì)量濃度接近250g/L時，上升趨勢趨于平緩，繼續(xù)增加下腳料溶液的質(zhì)量濃度，氨基酸態(tài)氮含量基本保持不變。這說明當下腳料質(zhì)量濃度超過最適底物質(zhì)量濃度后，發(fā)酵菌株質(zhì)量濃度相對變稀，而且過高的下腳料質(zhì)量濃度會限制微生物的運動，限制了微生物的發(fā)酵。因此，將250g/L作為最佳的貝類下腳料發(fā)酵質(zhì)量濃度。

2.2.2 復合菌株接種量對氨基酸態(tài)氮含量的影響

配制質(zhì)量濃度為250g/L的貝類下腳料溶液，調(diào)整pH值為7.0，分別接入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵72h，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨復合菌株接種量的不斷增加，溶液中氨基酸態(tài)氮含量逐漸提高，當接菌量為6%時，溶液中氨基酸態(tài)氮含量達到最高值，繼續(xù)增加接菌量，氨基酸態(tài)氮含量反而出現(xiàn)下降趨勢。這是因為接入過多的微生物后，其生長過程需要消耗游離態(tài)的氨基酸，導致溶液中氨基酸態(tài)氮含量降低。因此，確定6%作為復合菌株的最佳接種量。

圖5 復合菌株接種量對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of multi-culture starter inoculation on amino acid nitrogen content

2.2.3 pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響

配制質(zhì)量濃度為250g/L的貝類下腳料溶液，分別調(diào)節(jié)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，接入6%的復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，升溫至50℃發(fā)酵72h，結(jié)果見圖6。

圖6 pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of pH on amino acid nitrogen content

由圖6可知，pH值對氨基酸態(tài)氮含量的影響較大，氨基酸態(tài)氮含量先隨pH值的增大逐漸升高，pH值為7.0時接近最高值，pH值繼續(xù)增大，氨基酸態(tài)氮含量反而下降。這是因為每種微生物都有其最適的酸堿環(huán)境，偏離了最適生長的pH，其生長、繁殖和產(chǎn)酶能力都會迅速降低。因此，確定復合菌株發(fā)酵的最佳pH值為7.0。

2.2.4 發(fā)酵溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響

配制質(zhì)量濃度為250g/L的貝類下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值7.0，加入6%的復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，再調(diào)節(jié)溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃發(fā)酵72h，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨發(fā)酵溫度的不斷上升，氨基酸態(tài)氮含量先升后降，在50℃時氨基酸態(tài)氮含量最高，說明復合菌株生長過程中產(chǎn)生的酶在50℃時酶活力最大，較低和較高的發(fā)酵溫度都不利于酶解反應的進行。因此確定復合菌株的最佳發(fā)酵溫度是50℃。

2.2.5 發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響

配制質(zhì)量濃度為250g/L的貝類下腳料溶液，調(diào)節(jié)pH值7.0，加入6%的復合菌株，在35℃下培養(yǎng)48h，再在50℃下發(fā)酵48h、56h、64h、72h、80h、88h、96h，結(jié)果見圖8。

圖7 發(fā)酵溫度對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.7 Effect of temperature on amino acid nitrogen content

圖8 發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.8 Effect of time on amino acid nitrogen content

由圖8可知，發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮含量的影響也較大，氨基酸態(tài)氮含量先隨發(fā)酵時間的延長逐漸升高，72h時接近最高值，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，氨基酸態(tài)氮含量反而有所下降。這是由于部分游離氨基酸轉(zhuǎn)化成了菌體蛋白，因此，確定復合菌株的最佳發(fā)酵時間為72h。

2.2.6 正交試驗確定最佳的發(fā)酵工藝條件

在單因素試驗基礎上，以氨基酸態(tài)氮為考察指標，選取下腳料溶液質(zhì)量濃度、復合菌株接菌量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間進行L9（34）正交試驗，因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation process optimization

由表2可知，R值大小決定了這4個因素對氨基酸態(tài)氮含量影響的主次順序是A＞B=D＞C，即影響氨基酸態(tài)氮含量最大的因素為下腳料溶液的質(zhì)量濃度，其次是復合菌株接菌量和發(fā)酵時間，影響最小的是發(fā)酵溫度；最佳組合是A2B1C2D2，在此最佳條件下進行驗證試驗，結(jié)果A2B1C2D2組合的氨基酸態(tài)氮含量達到1.35%。確定最佳的發(fā)酵條件為貝類下腳料溶液質(zhì)量濃度250mg/L，接菌量5%，pH值為7.0，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間72h，此時水解液中氨基酸態(tài)氮含量為1.35%。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation process optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3方差分析結(jié)果可以看出，貝類下腳料溶液質(zhì)量濃度對氨基酸態(tài)氮含量有顯著影響（P＜0.05）。

3 結(jié)論

利用扇貝和鮑魚加工過程中的下腳料，采用米曲霉和熱帶假絲酵母按照1∶1（m/m）復合并進行協(xié)同發(fā)酵，在下腳料溶液質(zhì)量濃度為250g/L，pH值為7.0，復合菌株接種量5%的條件下，在35℃培養(yǎng)48h再升溫至50℃發(fā)酵72h，制得了氨基酸態(tài)氮含量為1.35%的貝類海鮮調(diào)味料。本研究采用微生物發(fā)酵法制備海鮮調(diào)味料，提高了產(chǎn)品的安全性，符合社會趨勢的要求，同時通過對海鮮下腳料深度加工利用，使海洋資源得到充分開發(fā)，創(chuàng)造出一定的經(jīng)濟價值。為更好地降低海鮮調(diào)味料中苦味并提高鮮味，需進一步加強風味酶脫苦和美拉德反應增鮮研究。

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