宋曉敏，李少英 *，馬春艷，李 貞，李淑芬

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是一類發(fā)酵產(chǎn)物主要為乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱，具有增強(qiáng)免疫、防止胃黏膜病變、減輕過敏癥狀、預(yù)防腸道病原菌感染等保健功能[1]，因此在食品工業(yè)上應(yīng)用廣泛。但目前工業(yè)上常用于發(fā)酵乳制品的乳酸球菌只有嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌等少數(shù)菌株[2]，急需更多的菌種來豐富發(fā)酵產(chǎn)品的種類。研究乳酸菌的生物多樣性可為工業(yè)生產(chǎn)提供更多樣、更優(yōu)質(zhì)的菌株選擇。內(nèi)蒙古民族乳制品有著品種多、樣式廣、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)[3]，而其中的乳酸菌更因菌種的多樣性受到專家學(xué)者的關(guān)注。由于內(nèi)蒙古民族乳制品的發(fā)酵是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，使得其中乳酸菌的生物學(xué)特性和基因多樣性得到了很好的保留，微生物的區(qū)系組成更是牧區(qū)微生態(tài)環(huán)境的直接體現(xiàn)。

氟喹諾酮類藥物在臨床上廣泛應(yīng)用于治療腸道感染，是腸道菌群最常接觸到的抗生素之一[4]。而乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的自然耐藥性可增強(qiáng)乳酸菌在腸道內(nèi)的定植能力，使其免受到抗生素的干擾，為有益乳酸菌微生態(tài)制劑與氟喹諾酮類抗菌藥制劑同時使用來維持腸道正常菌群、治療腸道感染提供可能。

本實(shí)驗(yàn)對內(nèi)蒙古牧區(qū)民族乳制品中的乳酸球菌進(jìn)行分離純化并分析菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥表型。篩選出對氟喹諾酮類藥物有抗性的菌株進(jìn)行生理生化鑒定和16S rRNA序列同源性分析，旨在為今后乳酸菌進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種，豐富發(fā)酵乳制品的種類；并為乳酸菌安全性研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為乳酸菌的安全應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

取自四子王旗（Siziwang Banner，SB）和達(dá)爾罕茂明安聯(lián)合旗（Darhan Muminggan，DM）牧區(qū)的自然發(fā)酵乳制品，包括酸奶和稀奶油。

1.1.2 培養(yǎng)基

膽鹽乳糖培養(yǎng)基（bile lactose，BL）培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含肝浸粉4.0g、蛋白胨5.0g、牛肉浸粉3.0g、酵母浸粉2.0g、胰酪蛋白胨5.0g、可溶性淀粉0.5g、L-半胱氨酸0.5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1.0g、磷酸氫二鉀1.0g、大豆胨3.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉0.01g、瓊脂15.0g、硫酸錳0.006 7g、吐溫-80 1.0mL。

TPY培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含胰蛋白胨8.0g、大豆蛋白胨3.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氫二鉀2.0g、磷酸二氫鉀3.0g、六水合氯化鎂0.5g、氯化鈉5.0g、七水合硫酸亞鐵0.01g、吐溫80 1.0mL。

MRS培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含牛肉膏10.0g、蛋白胨10.0g、磷酸氫二鉀2.0g、酵母浸膏5.0g、三水合醋酸鈉5.0g、檸檬酸二銨2.0g、吐溫-80 1mL、鹽液A（七水合硫酸鎂11.5g、四水合硫酸錳2.8g、蒸餾水1 000mL）5mL、葡萄糖20.0g。

雙料MRS培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含牛肉膏20.0g、蛋白胨20.0g、磷酸氫二鉀4.0g、酵母提取物10.0g、三水合醋酸鈉10.0g、檸檬酸二銨4.0g、吐溫-80 2mL、鹽液A 10mL（七水合硫酸鎂11.5g、四水合硫酸錳2.8g、蒸餾水1 000mL）、葡萄糖40.0g。

葡萄糖酵母膏蛋白胨（glucose yeast extract peotone，GYP）培養(yǎng)基：1L培養(yǎng)基中含葡萄糖20.0g、酵母提取物10.0g、蛋白胨10.0g、三水合醋酸鈉5.0g、吐溫-80 10mL、鹽液（七水合硫酸鎂40.0g、四水合硫酸錳2.0g、七水合硫酸亞鐵2.0g、氯化鈉2.0g、蒸餾水1 000mL）5mL。

1.1.3 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)所用抗生素標(biāo)準(zhǔn)品具體情況見表1。

表1 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的名稱、生產(chǎn)批號及來源Table 1 Name,batch number and source of antibiotic standards

1.1.4 菌株

質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922：美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

標(biāo)準(zhǔn)菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）CICC 23658：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.5 試劑

新型微量生化管：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×EasyTaqSuper Mix：TRANS；DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer、核酸染料：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖：美國Sigma公司。

1.1.6 16s rRNA擴(kuò)增引物

F：agagtttgatcctggctcag，R：aaggaggtgatccagcc，目的產(chǎn)物大小約為1 500bp。參照文獻(xiàn)[6]所提供的引物。

1.2 儀器與設(shè)備

350mL厭氧培養(yǎng)袋：青島海博生物技術(shù)有限公司；SPX-1500型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；OLYMPOSBX50型光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPOS公司；FLC-3型超凈工作臺：哈爾濱市東聯(lián)公司；快速梯度PCR儀：美國ABI公司；DYCP-31DN型電泳儀：北京市六一儀器廠；圖像記錄分析儀：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸球菌的分離純化及保存

用劃線法對樣品中的乳酸球菌進(jìn)行分離及純化。對分離純化得到的菌株進(jìn)行真空冷凍干燥保存，方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 分離菌株的初步鑒定

對分離菌株進(jìn)行初步鑒定以確定其為乳酸球菌，鑒定內(nèi)容包括革蘭氏染色并鏡檢、過氧化氫酶試驗(yàn)和脫脂乳發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.3 試驗(yàn)菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥性測定

用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。將3種氟喹諾酮類藥物的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）的耐藥標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行溶解，制備成高濃度的抗生素貯存液，-20℃保存。按照二倍稀釋法將抗生素貯存液進(jìn)行稀釋，設(shè)定藥物質(zhì)量濃度為800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL。

在無菌條件下將試驗(yàn)菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)3代，并用空培養(yǎng)基稀釋3代菌液至活菌數(shù)為107CFU/mL。按6%的接菌量接種于雙料MRS液體培養(yǎng)基中混勻，并加入到等體積稀釋好的藥物中。設(shè)置培養(yǎng)基空白、菌空白、藥物空白作為對照。37℃培養(yǎng)24h，用目視比濁法觀察并記錄最小抑菌濃度（MIC）。參照CLSI藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)中腸球菌屬M(fèi)IC解釋標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)果進(jìn)行判讀[8]，做3次重復(fù)試驗(yàn)，解釋判讀標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 腸球菌屬M(fèi)IC解釋標(biāo)準(zhǔn)Table 2 MIC interpretation standards of Enterococcus

1.3.4 試驗(yàn)菌株的生理生化鑒定

試驗(yàn)菌株活化培養(yǎng)3代，按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、溫度生長試驗(yàn)、pH生長試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氣試驗(yàn)、發(fā)酵蔗糖產(chǎn)葡聚糖試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.5 試驗(yàn)菌株的16S rRNA序列擴(kuò)增及分析

將活化培養(yǎng)的第3代菌液，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。對試驗(yàn)菌株的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系為50μL，其中2×EasyTaqSuper Mix 25μL、上下游引物各2μL、模板DNA 2μL、剩余無菌水補(bǔ)足。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，57.4℃退火30s，72℃延伸90s，72℃末端延伸5min，35個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物測序，所得序列拼接后用美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上的基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對其同源性進(jìn)行分析，并用DNAstar軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株初步鑒定

初步鑒定結(jié)果顯示，試驗(yàn)菌株均為革蘭氏陽性球菌，且過氧化氫酶陰性，發(fā)酵脫脂乳陽性，可初步判定為乳酸菌。

2.2 試驗(yàn)菌株的耐藥表型

2.2.1 試驗(yàn)菌株MIC測定結(jié)果

試驗(yàn)菌株的MIC測定結(jié)果如表3所示，MIC1、MIC2、MIC3分別為3次重復(fù)試驗(yàn)的測定結(jié)果。

由表3可知，對3種氟喹諾酮類藥物顯示耐藥的試驗(yàn)菌株的MIC大部分超出了試驗(yàn)可測定的最大值400 μg/mL，試驗(yàn)菌株呈現(xiàn)高度耐藥。

表3 試驗(yàn)菌株MIC測定結(jié)果Table.3 MIC determination results of tested strains

2.2.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性分析

由于MIC測定所得數(shù)據(jù)非正態(tài)分布，故先將數(shù)據(jù)取對數(shù)使其符合方差分析的數(shù)據(jù)要求（＞400 μg/mL按800 μg/mL計(jì)，＜0.78 μg/mL按0.78 μg/mL計(jì)）。用SPSS軟件對取對數(shù)后的MIC數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以檢測試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，18株試驗(yàn)菌株對3種氟喹諾酮類藥物的平均標(biāo)準(zhǔn)差、均值、變異系數(shù)如表4所示。

表4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)Table 4 Standard deviation and variation coefficient of experimental data

由表4方差分析結(jié)果可知，3種氟喹諾酮類藥物藥物的MIC測定的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均＜8%，試驗(yàn)重復(fù)性良好，結(jié)果可反映18株試驗(yàn)菌株的真實(shí)耐藥情況。

2.2.3 試驗(yàn)菌株對抗生素的耐藥結(jié)果判定

參照CLSI藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)中腸球菌屬M(fèi)IC解釋（見表2），對18株試驗(yàn)菌株及質(zhì)控菌株（大腸埃希氏菌）的MIC結(jié)果進(jìn)行判讀，結(jié)果如表5所示。

表5 試驗(yàn)菌株的耐藥結(jié)果Table 5 Drug resistance of tested strains

由表5可知，除DM22和DM32外的其他試驗(yàn)菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星3種抗生素均呈現(xiàn)耐藥。DM22對3種抗生素均為中介；DM32對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感，對諾氟沙星為中介。試驗(yàn)菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率均高達(dá)88.9%。

2.3 耐藥菌株的生理生化鑒定

篩選出對3種抗菌藥的MIC均＞400 μg/mL（所設(shè)定的最高濃度）的菌株SB4、SB26、DM33、DM41 及對3種抗菌藥都處于中介的菌株DM22。對這5株菌進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果如表6、表7所示。

由表6可知，5株試驗(yàn)菌株均為同型發(fā)酵，在10℃和45℃均可生長，SB4、SB26、DM41在50℃也可生長；5株試驗(yàn)菌株在酸性（pH4.8）和堿性（pH9.6）條件下均可生長，耐6.5%的NaCl，均能分解精氨酸產(chǎn)氨氣，其中DM22和DM33可發(fā)酵蔗糖產(chǎn)微量的葡聚糖。

表6 耐藥菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 6 Physiological and biochemical identification results of drug resistant strain

表7 糖發(fā)酵結(jié)果Table 7 Sugar fermentation results

由表7可知，5株耐藥菌株均可發(fā)酵果糖和乳糖，此外，SB4、SB26、DM41還能發(fā)酵棉籽糖和阿拉伯糖。

根據(jù)文獻(xiàn)[9]中的兩歧法對試驗(yàn)菌株的屬種進(jìn)行判定，SB4、SB26、DM41 初步判定為屎腸球菌（Enterococcus faecium），DM22、DM33初步判定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），同時標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23658判定為糞腸球菌。

2.4 耐藥菌株16S rRNA序列同源性

提取得到的試驗(yàn)菌株基因組總DNA經(jīng)電泳檢測，條帶遠(yuǎn)大于2 000bp，符合試驗(yàn)預(yù)期。PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。由圖1可知，產(chǎn)物條帶約為1 500bp，與文獻(xiàn)中該引物所擴(kuò)增的目的產(chǎn)物大小相同。

圖1 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.1 Electrophoresis detection of 16s rRNA gene PCR product

5株試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列與GenBank中已知菌株的基因序列進(jìn)行同源性比對，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2 試驗(yàn)菌株與其他乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of tested strains and other lactic acid bacteria

圖2結(jié)果表明，SB4、SB26、DM41與屎腸球菌同源性最高，由此可判定這3株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。DM22、DM33與堅(jiān)強(qiáng)腸球菌同源性均高達(dá)99.4%，由此可判定DM22和DM33都為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcus durans），與生化鑒定結(jié)果有出入，可能的原因是生化鑒定不能有效鑒別部分親緣關(guān)系近的菌種。同時，標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23658與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）同源性為99.9%，說明試驗(yàn)結(jié)果可信。

3 討論

腸球菌是人和動物腸道中的正常菌群，廣泛存在于乳制品和發(fā)酵食品中[10-12]。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道，在歐洲國家已有十多株腸球菌被允許用于食品中[13]，隨著微生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展，腸球菌也可越來越多地用于微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。另外，屎腸球菌和堅(jiān)強(qiáng)腸球菌都可產(chǎn)生具有抑菌作用的腸球菌素[14]。因此，在腸球菌進(jìn)行安全性評價的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于乳制品、肉制品的發(fā)酵已成為發(fā)酵劑開發(fā)和研究的熱點(diǎn)。

目前研究認(rèn)為，細(xì)菌耐藥性一般可以大致分為2種：一是固有性耐藥，二是獲得性耐藥。固有性耐藥一般不會發(fā)生轉(zhuǎn)移；但獲得性耐藥菌株容易發(fā)生耐藥基因的轉(zhuǎn)移，可能轉(zhuǎn)移到其他乳酸菌或致病菌中[15]。因此，研究耐藥菌株是否為獲得性耐藥對耐藥菌株今后的安全應(yīng)用顯得尤為重要。自然發(fā)酵乳中的乳酸菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因，以及會不會發(fā)生轉(zhuǎn)移都有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

從自然發(fā)酵乳中分離初步鑒定為乳酸菌的18株球菌對左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同程度的耐藥，耐藥率均高達(dá)88.9%。對篩選出的4株高度耐藥和1株中介菌株進(jìn)行生理生化鑒定和16S rRNA序列同源性分析，鑒定結(jié)果顯示SB4、SB26、DM41為屎腸球菌（Enterococcus faecium），DM22、DM33為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌（Enterococcusdurans）。

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