龍茜萍，王曉丹，譚 靜，張小龍，邱樹毅*

（1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州貴酒有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550001；3.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

微生物飼料添加劑是近幾十年發(fā)展起來的一種新型飼料添加劑，是指可直接喂食或在飼料中適量添加以增加有益菌、微生物酶、蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)腸胃功能等的微生物菌劑制品[1-3]。

隨著市場的需求和白酒行業(yè)的不斷發(fā)展，白酒副產(chǎn)物丟糟大量產(chǎn)生，而根據(jù)白酒丟糟的特點、從循環(huán)經(jīng)濟以及可持續(xù)發(fā)展考慮，研究者對白酒丟糟的資源化利用進行了較多的研究[4-7]。本實驗利用醬香型白酒丟糟培養(yǎng)酵母制備酵母飼料添加劑，以期減少丟糟污染，保護環(huán)境，達到合理利用醬香型白酒丟糟的目的[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒丟糟：貴州某酒廠提供；麩皮：市場購買；菌種：熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1254、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）1314、釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）1355：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；IS516酵母：本實驗室分離得到。

麥芽汁液體培養(yǎng)基：130.1g麥芽汁液體培養(yǎng)基，1 000mL蒸餾水，自然pH。麥芽汁固體培養(yǎng)基（青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司）：145.1g麥芽汁固體培養(yǎng)基，1000mL蒸餾水，自然pH。

酒糟培養(yǎng)基：7.5g預(yù)處理的酒糟，2g葡萄糖，75mL水，pH 4.5～5.0。

硼酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：成都科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；硫酸銅（分析純）：重慶北碚精細(xì)化工廠；硫酸鉀K2SO4（分析純）：湖南湘中地質(zhì)實驗研究所；硫酸H2SO4（分析純）、鹽酸HCl（分析純）：重慶川江化學(xué)試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-258B-Z生化培養(yǎng)箱、BXM-50R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZD-85雙功能氣浴振蕩器：常州澳華儀器有限公司；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；EX224電子天平：上海菁海儀器有限公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；K9840凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒糟的組分測定

水分含量的測定：干燥法[11]；灰分含量的測定：灰化法[12]；還原糖含量的測定：滴定法[13]；蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法[14]；pH值的測定：取酒糟用蒸餾水按酒糟比水1∶10，在室溫條件下?lián)u勻，浸泡30min后過濾，直接用酸度計測定濾液pH值。

1.3.2 酒糟的預(yù)處理及種子液的制備

將新鮮酒糟在60℃下烘干48h，將烘干的酒糟用篩子去除谷殼，將去除谷殼后的酒糟粉碎至粉末狀，以備后期試驗的使用。

將保存的菌種接種到試管斜面麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上活化待用。將活化好的菌種接種到滅菌麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)2～3d，即為種子液。各菌劑分開培養(yǎng)，再分別接種到酒糟培養(yǎng)基后再混合，成為混合發(fā)酵液。

1.3.3 培養(yǎng)基的確定及菌種馴化

不同培養(yǎng)時間下發(fā)酵液中菌數(shù)變化：酒糟7.5g，葡萄糖1.5g，水75mL，自然pH，接種8mL種子液，28℃培養(yǎng)3～7d后，通過平板計數(shù)法[10]測定菌數(shù)。

不同葡萄糖下發(fā)酵液中菌數(shù)變化：酒糟7.5g，葡萄糖分別為0、0.5g、1.5g、2.0g、2.5g，水75mL，自然pH，接種8mL種子液，28℃培養(yǎng)5d，菌落計數(shù)。

不同接種量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化：酒糟7.5g，葡萄糖2g，水75mL，自然pH，分別接種5mL、8mL、10mL種子液，28℃培養(yǎng)5d，菌落計數(shù)。

不同酒糟含量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化：酒糟分別為5.0g、7.5g、15.0g，葡萄糖2g，水75mL，自然pH，接種8mL種子液，28℃培養(yǎng)5d，菌落計數(shù)。

1.3.4 單菌和混菌培養(yǎng)

酒糟7.5g，葡萄糖2g，水75mL混合均勻，調(diào)節(jié)pH為4.5～5.0，包扎，121℃滅菌20min。分別接種熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、實驗室酵母及4種酵母種子液的混合液，28℃培養(yǎng)5d，當(dāng)菌數(shù)達到一定數(shù)目時，向酒糟菌懸液75mL中填充28g麩皮，33℃條件下烘干20～22h，得到飼料添加劑。

1.3.5 飼料添加劑相關(guān)指標(biāo)的測定

水分含量的測定：干燥法[11]；灰分含量的測定：灰化法[12]；蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法[14]；菌數(shù)的測定：平板計數(shù)法[15]；雜菌數(shù)的測定：平板計數(shù)法[15]。

2 結(jié)論與分析

2.1 酒糟的成分測定結(jié)果

貴州某酒廠提供的醬香型白酒丟糟pH值為3.94，成分測定結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，該醬香型白酒丟糟有一定的營養(yǎng)成分，適合酵母生長。

表1 醬香型白酒丟糟成分測定Table 1 Composition determination of Moutai-flavor liquor distiller’s grains

2.2 不同因素對白酒丟糟發(fā)酵的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)時間下發(fā)酵液中菌數(shù)變化

培養(yǎng)時間對發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖1可知，前3d為酵母發(fā)酵的調(diào)整期，菌數(shù)較少，第4天進入對數(shù)期，發(fā)酵液菌數(shù)增加明顯，第5天為穩(wěn)定期，菌數(shù)達到最大，6～7d為衰亡期，發(fā)酵液菌數(shù)快速下降，因此，選擇5d為酵母發(fā)酵的最佳時間。

圖1 不同培養(yǎng)時間下發(fā)酵液中菌數(shù)變化Fig.1 Change of yeast amount in fermentation mash with different culture time

2.2.2 不同葡萄糖添加量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化

葡萄糖的添加量對發(fā)酵的影響如圖2所示。由圖2可知，葡萄糖的添加量為2.0g時，發(fā)酵液菌數(shù)較大；葡萄糖添加量為2.5g時，發(fā)酵液菌數(shù)和2.0g時相差不大，因此，葡萄糖的添加量選擇2.0%為最佳。

圖2 不同葡萄糖下發(fā)酵液中菌數(shù)變化Fig.2 Change of yeast amount in fermentation mash with different glucose content

2.2.3 不同酵母接種量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化

接種量對酵母發(fā)酵的影響如圖3所示。從圖3可知，酵母接種量為8mL，發(fā)酵液菌數(shù)較大；酵母接種量為10mL，發(fā)酵液菌數(shù)和8mL接種量時相差不大，因此選擇10%為最佳酵母接種量。

圖3 不同接種量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化Fig.3 Change of yeast amount in fermentation mash with different inoculum size

2.2.4 不同酒糟含量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化

酒糟含量對發(fā)酵的影響如圖4所示。由圖4可知，酒糟含量為7.5g時，發(fā)酵液菌數(shù)較大；酒糟含量為15g，發(fā)酵液菌數(shù)和酒糟含量7.5g時相差不大，因此選擇料液比為1∶10為最佳酒糟含量。

圖4 不同酒糟含量下發(fā)酵液中菌數(shù)變化Fig.4 Change of yeast amount in fermentation mash with different distiller’s grains content

2.3 單菌和混菌培養(yǎng)的結(jié)果

單菌和混菌的發(fā)酵液及制備的飼料添加劑菌數(shù)如表2所示。由表2可知，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和馴化后的菌種發(fā)酵5d后，發(fā)酵液中菌數(shù)達到1010CFU/mL，經(jīng)填充烘干制成飼料添加劑后，菌數(shù)達到108CFU/g，是良好的復(fù)合飼料添加劑，可配制成飼料，也可直接喂食。

2.4 飼料添加劑相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果

測定制備好的飼料添加劑的菌數(shù)、水分、蛋白質(zhì)、灰分、雜菌數(shù)，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，制備成飼料添加劑后的菌數(shù)均達到108CFU/g，水分在9%左右，利于保存，蛋白質(zhì)含量也有所增加，營養(yǎng)成分提高，沒有雜菌。

表2 單菌和混菌的發(fā)酵液及飼料添加劑中的菌數(shù)Table 2 Single and mixed bacteria fermented mash and yeasts in feed additives

表3 飼料添加劑相關(guān)質(zhì)量指標(biāo)Table 3 Feed additives related quality indicators

3 結(jié)論

通過對某酒廠提供的醬香型白酒丟糟的測定，得出其水分為65.8%，灰分為2.9%，蛋白含量為9.26%，還原糖為1.44%，pH值為3.94，對酒糟進行預(yù)處理后，通過實驗得出，料液比為1∶10，接種量為10%，葡萄糖為2%，培養(yǎng)時間為5d為最佳培養(yǎng)組合，當(dāng)pH為4.5～5.0，比自然pH具有生長優(yōu)勢，得出的酒糟菌懸液菌數(shù)可達到1010CFU/mL。以酒糟菌懸液與麩皮比為5:3填充后，33℃條件下20～22h烘干后，得到酵母飼料添加劑，菌數(shù)達到108CFU/g，蛋白質(zhì)含量達到22%，是一種很好的復(fù)合飼料添加劑。

[1]尹 苗，楊桂文，安利國.微生物飼料添加劑的研究進展[J].糧食與飼料工業(yè)，2001（3）：35-37.

[2]王金合.微生態(tài)飼料添加劑及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（2）：36-38.

[3]鄒明鑫，邱樹毅，王曉丹，等.利用醬香型白酒丟糟生產(chǎn)微生物飼料添加劑的初步研究[J].釀酒科技，2013（7）：91-93.

[4]喬家運，馮占雨，王文杰，等.利用白酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)豬用生物飼料的研究及應(yīng)用[J].養(yǎng)豬，2013（2）：17-19.

[5]劉達玉，黃 丹，夏兵兵，等.組合菌種發(fā)酵制備酒糟飼料的研究[J].四川理工學(xué)院學(xué)報，2008（12）：68-70.

[6]王肇穎，肖 敏.白酒酒糟的綜合利用及其發(fā)展前景[J].釀酒科技，2004（1）：65-67.

[7]馬曉建，陳俊英，張如意，等.酒糟綜合利用的發(fā)展前景[J].釀酒科技，2006（4）：96-98.

[8]施安輝.國內(nèi)白酒工業(yè)固體酒糟環(huán)保生態(tài)化利用的現(xiàn)狀及前景[J].中國釀造，2006，25（3）：4-6.

[9]劉 軍，牛廣杰，孫東偉.混合菌種協(xié)同發(fā)酵酒糟生產(chǎn)菌體飼料蛋白的研究[J].釀酒科技，2009（9）：116-118.

[10]袁 頡，邱樹毅，彭正東，等.固態(tài)白酒生產(chǎn)酒糟的資源化利用研究進展[J].釀酒科技，2012（5）：88-91.

[11]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB5009.3—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[12]吳國峰，李國全，馬永強.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[13]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB5009.7—2008 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.5—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[15]周德慶.微生物學(xué)實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2006.