李哲，吳曉青，趙曉燕，魏艷麗，李紀(jì)順，楊合同，2*

(1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250014;2.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 250049)

土壤鹽漬化是影響植物生長(zhǎng)的主要逆境因素之一［1］。NaCl是鹽漬化土壤中最主要的成分，對(duì)植物造成的傷害是多方面的。NaCl脅迫下，植物會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)失衡和滲透功能受損，活性氧過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致膜完整性的破壞，進(jìn)而引起光合電子傳遞系統(tǒng)失活、激素平衡破壞、生物量積累下降、蛋白質(zhì)變性、核酸斷裂甚至細(xì)胞死亡［2］。光合作用決定著植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量［3］，NaCl脅迫對(duì)植物光合特性的影響程度決定著植物的抗鹽能力和產(chǎn)量水平，可用作判斷植物生長(zhǎng)和抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)［4－5］。光合作用通過(guò)兩個(gè)光系統(tǒng) (PSI和PSII)將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，其中PSII被認(rèn)為對(duì)NaCl脅迫尤其敏感，在植物響應(yīng)NaCl脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。因此，許多學(xué)者圍繞NaCl脅迫對(duì)不同植物品種、植物組織PSII光化學(xué)活性的影響進(jìn)行了廣泛探討［3，5－6］。

椒樣薄荷(Mentha piperita L.)是唇形科薄荷屬多年生草本植物，是天然香料，香氣純正、清爽宜人，廣泛用于日用化妝品、醫(yī)藥和糖果食品，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［7－8］。本實(shí)驗(yàn)室在鹽漬化土壤經(jīng)多年馴化篩選出了抗鹽椒樣薄荷品系——科院一號(hào)，適合在黃河三角洲地區(qū)鹽漬土壤上大規(guī)模推廣種植。課題組還首次開(kāi)展了椒樣薄荷響應(yīng)NaCl脅迫的生理特性的研究，發(fā)現(xiàn)它能夠耐受0.8%的NaCl脅迫，在該濃度下，椒樣薄荷植株能正常生長(zhǎng)，并維持較高的含水量、較低的滲透勢(shì)、較低的電導(dǎo)率和Na+含量，但在遭受更高的NaCl脅迫時(shí)會(huì)受到一定程度的傷害［9］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)椒樣薄荷的研究與開(kāi)發(fā)主要聚焦于精油組分的分析和提取，對(duì)其耐鹽特性研究較少，對(duì)NaCl脅迫下椒樣薄荷光合系統(tǒng)活性變化的研究更是尚未開(kāi)展。本試驗(yàn)以抗鹽椒樣薄荷品系為試材，對(duì)不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷光合作用和PSII光化學(xué)活性的變化進(jìn)行了研究，有助于深入了解椒樣薄荷的耐鹽機(jī)制，為其栽培管理、耐鹽品種的選育及耐鹽脅迫的人工調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用椒樣薄荷(Mentha piperita L.)為本實(shí)驗(yàn)室在鹽漬化土壤多年馴化篩選出的抗鹽品系(科院一號(hào))。在人工氣候室內(nèi)于光暗周期為10 h/14 h，晝夜溫度為26/20℃，空氣相對(duì)濕度為50% ～70%的條件下，大量培養(yǎng)椒樣薄荷植株，選取生長(zhǎng)期(10葉期)一致的植株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中所用的主要儀器有葉片面積測(cè)量?jī)x (LI-3100C，LI-COR，USA)，光合速率測(cè)定儀 (LI-6400;LICOR，USA)，葉綠素?zé)晒鈨x (PAM MINI，德國(guó) Walz)，酶標(biāo)儀 (Infinite 200，瑞士 Tecan)和電子天平(FA1004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)處理

取普通耕作土和營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)按1:1比例混合，混勻過(guò)篩后裝于塑料盆中。選取生長(zhǎng)良好、大小一致(10葉期)的椒樣薄荷植株，移于塑料盆(每盆3株)中。培養(yǎng)7d后，分別以含有不同濃度NaCl(濃度分別為0、100、150、200mmol/L)的Hoagland溶液處理12 d，每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)。為了避免鹽激作用對(duì)植株的影響，采用每12 h遞增50mmol/L，直至達(dá)到最終NaCl濃度。每天用相應(yīng)的NaCl溶液澆灌一次，澆灌量為土壤持水量的2倍，約2/3的溶液流出，從而將以前的積余鹽沖洗掉，以保持NaCl濃度恒定。

1.3 椒樣薄荷植株生長(zhǎng)狀況的測(cè)定

分別取經(jīng)不同濃度NaCl處理后的3株椒樣薄荷植株的地上部，利用電子天秤稱量鮮重。然后選取3株椒樣薄荷的葉片(從下往上數(shù)第3對(duì)葉)，利用葉片面積測(cè)量?jī)x來(lái)測(cè)定葉片面積。

1.4 凈光合速率(Pn)、光合電子傳遞速率(ETR)和葉綠素含量的測(cè)量

分別取經(jīng)不同濃度NaCl處理后的椒樣薄荷葉片(從下往上數(shù)第3對(duì)葉)，用便攜式光合速率測(cè)定儀來(lái)測(cè)量椒樣薄荷葉片的凈光合速率(Pn)和光合電子傳遞速率(ETR)［10］。LI-6400裝有6400-15葉室(直徑1.0 cm)，使用人工光源，光照強(qiáng)度為20000 Lx的飽和光。內(nèi)置CO2注入系統(tǒng)，控制葉室CO2濃度為500mg/m3?？?cè)~綠素含量用95%(V/V)乙醇提取，分光光度計(jì)法測(cè)定［6］。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的檢測(cè)

采用葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組椒樣薄荷成熟葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測(cè)定前，將葉片放置到暗適應(yīng)夾中適應(yīng)25～30min。測(cè)定時(shí)，將葉片放置到樣品室，打開(kāi)檢測(cè)光，測(cè)定初始熒光;然后照射飽和脈沖光，每2.5 s一個(gè)脈沖，成像并測(cè)定反映PSII光化學(xué)活性的熒光參數(shù):PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、PSII有效光化學(xué)量子產(chǎn)量(Y(II))、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和可變熒光(Fv)［10］。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用SPSS和Origin統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析和制圖，計(jì)算各處理性狀的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷生長(zhǎng)狀況和生物量的影響

在100和150mmol/L NaCl處理下，與對(duì)照相比，椒樣薄荷的生長(zhǎng)表型、鮮重以及葉片面積沒(méi)有受到明顯的影響，而在200mmol/L NaCl處理下，其生長(zhǎng)表型、鮮重以及葉片面積均呈現(xiàn)出顯著的抑制和下降 (圖1～3)。200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷鮮重以及葉片面積的下降與同期對(duì)照相比十分顯著 (P＜0.05)，分別降至了同期對(duì)照的 56.63% 和63.62%(圖2～3)。

圖1 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷生長(zhǎng)狀況的影響Fig.1 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the growth condition of peppermint.

圖2 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷鮮重的影響Fig.2 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the fresh weight of peppermint

圖3 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷葉片面積的影響Fig.3 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the leaf area of peppermint

2.2 NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷Pn、ETR和葉綠素含量的影響

如圖4～5所示，在100和150mmol/L NaCl處理下，與對(duì)照相比，椒樣薄荷葉片的凈光合速率和光合電子傳遞速率值略有波動(dòng)，但沒(méi)有受到明顯的影響，差異未達(dá)到顯著水平。而在200mmol/L NaCl處理下，Pn和ETR隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)有所下降 (P＜0.05)。200mmol/L NaCl處理6 d后，Pn和ETR分別降至了同期對(duì)照的66.67%和62.22%，而在200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷葉片Pn和ETR的下降與同期對(duì)照相比更加明顯，分別降至了同期對(duì)照的34.29%和38.11%(圖4～5)。葉綠素含量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)顯示，在100和150mmol/L NaCl處理12 d后，與同期對(duì)照相比，葉綠素含量沒(méi)有受到明顯的影響，差異未達(dá)到顯著水平。而在200mmol/L NaCl處理12 d后，葉綠素含量明顯下降，降至了同期對(duì)照的56.69%(圖6)。

圖4 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷葉片Pn的影響Fig.4 Impacts of different concentrations of NaCl stress on Pn value of peppermint leaf

圖5 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷葉片ETR的影響。Fig.5 Impacts of different concentrations NaCl stress on ETR value of peppermint leaf

圖6 不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷葉片總?cè)~綠素含量的影響Fig.6 Impacts of different concentrations of NaCl stress on the totalchlorophyllcontentof peppermint leaf

圖7 不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的成像Fig.7 Image of chlorophyll fluorescence parameters of peppermint leaf for different concentrations of NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷葉片PSII光化學(xué)活性的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷光合系統(tǒng)的損傷機(jī)制，我們利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)檢測(cè)了NaCl脅迫下PSII光化學(xué)活性的變化。熒光參數(shù)Fv/Fm反映了PSII的最大量子產(chǎn)量，Y(II)則反映了PSII的有效量子產(chǎn)量，它們都能夠反映PSII的光化學(xué)效率及活性［11］。葉綠素?zé)晒獬上窦岸糠治龅膶?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在100和150mmol/L NaCl處理下，與對(duì)照相比，椒樣薄荷葉片的Fv/Fm和Y(II)值沒(méi)有受到明顯的影響，差異未達(dá)到顯著水平(圖7、圖8A、B);而在200mmol/L NaCl處理下，其Fv/Fm和Y(II)值明顯下降，而且這個(gè)下降過(guò)程依賴于NaCl的處理濃度和處理時(shí)間 (圖7、圖8A、B)。200mmol/L NaCl處理6 d后，與同期對(duì)照相比，F(xiàn)v/Fm和Y(II)值分別下降了25.38%和29.88%，而在200mmol/L NaCl處理12 d后，椒樣薄荷Fv/Fm和Y(II)值的下降與同期對(duì)照相比更加明顯，分別下降了38.5%和46.6%(圖8A、B)。

圖8 不同濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of chlorophyll fluorescence parameters of peppermint leaf for different concentrations of NaCl stress

2.4 NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷PSII中QA到QB之間電子傳遞的影響

在PSII復(fù)合體中，QAFe2+QB復(fù)合體是PSII的電子傳遞終端受體，QA到QB之間的電子傳遞依賴于Fe2+的活性和作用，它們之間的電子線性傳遞是光合電子傳遞鏈的重要組成部分，QA到QB之間的電子傳遞是PSII中敏感的易損傷靶點(diǎn)［3，10－11］。因此，檢測(cè)能夠反映QA到QB之間電子傳遞的葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP和Fv的變化。穩(wěn)態(tài)的光化學(xué)淬滅系數(shù)qP和可變熒光參數(shù)Fv的大小和強(qiáng)度都能夠反映還原態(tài)QA－的含量。qP的值越低，表明 QA－的含量越高［12］;Fv的值越高，表明 QA－的含量越高［13－14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在100mmol/L和150mmol/L NaCl處理下，與對(duì)照相比，椒樣薄荷葉片qP和Fv值沒(méi)有受到明顯的影響，差異未達(dá)到顯著水平 (圖7，圖8C、D);而在200mmol/L NaCl處理下，qP值明顯的降低 (圖7，圖8C)，而Fv值明顯的升高 (圖7，圖8D)，差異均達(dá)到了顯著水平，表明了還原態(tài)QA－含量的增加，說(shuō)明QA到QB之間電子傳遞受到了阻斷。

3 結(jié)論

我們利用光合作用測(cè)定儀和葉綠素?zé)晒鈨x研究了不同濃度NaCl脅迫對(duì)椒樣薄荷光合作用和PSII光化學(xué)活性的影響，得出以下結(jié)論:

(1)植物生長(zhǎng)狀態(tài)是植物對(duì)NaCl脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，是植物耐鹽性的直接指標(biāo)。在NaCl脅迫下，椒樣薄荷的生長(zhǎng)和生物量呈現(xiàn)出了濃度依賴性的變化。在100和150mmol/L NaCl處理時(shí)，椒樣薄荷能保持正常的生長(zhǎng)狀況，維持正常的鮮重以及葉片面積，但在200mmol/L NaCl處理下，其生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，對(duì)椒樣薄荷植株造成了一定程度的傷害，這與椒樣薄荷植株在高濃度NaCl處理后萎蔫的表型是一致的。

(2)NaCl脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和代謝的影響是多方面的，尤以對(duì)光合作用的影響最為突出。100和150mmol/L的NaCl處理并未對(duì)椒樣薄荷葉片的凈光合速率Pn、光合電子傳遞速率ETR以及葉綠素含量產(chǎn)生明顯的影響，而在200mmol/L NaCl處理下，Pn、ETR和葉綠素含量均顯著的下降。之前的研究表明，在低濃度NaCl處理過(guò)程中，椒樣薄荷葉片中Na+含量變化不明顯，而高濃度NaCl脅迫下椒樣薄荷葉片中Na+含量明顯增加。由此推測(cè)，200mmol/L NaCl引起的光合損傷可能是由于高NaCl脅迫導(dǎo)致椒樣薄荷葉片細(xì)胞中Na+的大量累積，引起了葉片光合器官的損傷，造成葉綠素含量降低和葉肉細(xì)胞光合活性下降。

(3)PSII是光合系統(tǒng)中最敏感的組分，在植物光合系統(tǒng)對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)激中起著重要的作用，QA到QB之間的電子傳遞是PSII中敏感的易損傷靶點(diǎn)。NaCl脅迫下，植物進(jìn)行光合作用受到傷害的最初部位是與PSII緊密聯(lián)系的。100和150mmol/L的NaCl處理對(duì)椒樣薄荷PSII活性沒(méi)有顯著影響。而200mmol/L NaCl脅迫顯著降低了Fv/Fm和Y(II)值，抑制了QA到QB之間的電子傳遞，導(dǎo)致PSII電子傳遞鏈的阻斷，使椒樣薄荷葉片發(fā)生了光抑制。

綜上所述，在100和150mmol/L NaCl脅迫下，椒樣薄荷能夠正常生長(zhǎng)，光合活性以及PSII光化學(xué)活性沒(méi)有受到明顯的影響。隨著NaCl處理濃度的提高，200mmol/L NaCl脅迫抑制了PSII受體側(cè)QA到QB之間的電子傳遞活性，阻斷了光合電子傳遞鏈，造成了椒樣薄荷葉片光合活性和PSII光化學(xué)活性的顯著下降。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度NaCl脅迫下抗鹽椒樣薄荷品系光合作用和PSII光化學(xué)活性的變化，這有助于深入了解椒樣薄荷的耐鹽機(jī)制，為其栽培管理、耐鹽品種的馴化選育及耐鹽脅迫的人工調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

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