高 煥，薛 蓓，趙 蓮，于 飛，賴曉芳，閻斌倫，董麗君，孟 夢

（1.淮海工學院a.江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室；b.海洋學院，江蘇 連云港 222005；2.連云港市漁業(yè)技術(shù)指導站，江蘇 連云港 222001）

0 引言

脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda，Holthuis）作為我國特有的物種，在我國沿海區(qū)域均有分布，其中尤以黃海、渤海產(chǎn)量最多［1］。該蝦具有繁殖能力強（1年內(nèi)可多次產(chǎn)卵，繁殖期8個月）、生長速度快（1年內(nèi)可多茬養(yǎng)殖）、生長季節(jié)長（生長期11個月）和環(huán)境適應性廣（耐低氧、廣溫、廣鹽和廣食）等優(yōu)點［2］，因此，其人工養(yǎng)殖前景十分廣闊。在脊尾白蝦的各種養(yǎng)殖模式［3］中，一種秋冬季養(yǎng)殖模式很值得關(guān)注。因為該蝦具有很強的溫度適應性（2～39℃），即使在水溫低于－3℃時也不會凍死［3］，在溫度18～24℃之間胚胎都可以進行正常的發(fā)育［4］，因此很適合秋冬季時節(jié)氣溫還比較低的情況下養(yǎng)殖。為了更好地發(fā)揮該蝦的低溫養(yǎng)殖特性，有必要對該蝦的相關(guān)低溫生物學特征進行研究，以便為培育耐低溫特性的快速生長新品系或品種提供指導和幫助。本研究希望從溫度這一環(huán)境因素入手，通過對脊尾白蝦血清中酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）活性、堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）活性、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）濃度、過氧化物酶（peroxydase，POD）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T－AOC）的檢測，來探討脊尾白蝦應答溫度變化的生理反應機制，以便為更好地利用這一機制培育耐低溫的新品種提供指導幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用脊尾白蝦為連云港地區(qū)養(yǎng)殖池塘中捕獲的個體。選擇大小相近的個體，平均體長為（2.14±0.47）cm、體質(zhì)量（5.85±0.40）g。經(jīng)室內(nèi)暫養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 實驗分組及溫度設置

共分為實驗組和對照組2組，每組放入脊尾白蝦40尾。每組蝦放于玻璃缸中，并把玻璃缸放于塑料泡沫箱中，通過水浴的方式控制溫度，溫度精確度為±0.5℃。實驗過程中對照組一直保持25℃不變，實驗組則從25℃起，每h降1℃，降至5℃時，開始升溫，升溫幅度為每h升1℃，直到水溫恢復到25℃為止。期間，分別在降溫階段的25，20，15，10，5℃和升溫階段的10，15，20，25℃共9個時間點取樣，每次取樣數(shù)量為3尾。

1.3 血淋巴制備

用注射器從脊尾白蝦心臟中插入抽取血淋巴，置于1.5mL Eppendorf管中，并與抗凝劑（NaCl 450mmol／L，KCl 10mmol／L，EDTA.2Na 10mmol／L，HEPES 10mmol／L）以體積比1∶1混合均勻，經(jīng)冷凍高速離心后析出上層血清以供酶活性測定。

1.4 非特異免疫因子活性測定

本實驗所用藥品購自南京生物工程研究所，共測定5種因子的活性或濃度：酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、總抗氧化能力（T－AOC）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫（H2O2）。相關(guān)因子的測定方法參考試劑盒說明書進行。血清中蛋白濃度采用考馬斯亮藍法測定，具體參見試劑盒（南京生物工程研究所）使用說明書。牛血清白蛋白（AMRESCO公司）為標準蛋白。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用成組數(shù)據(jù)的t－test法對處理組和對照組進行比較。P＜0.05時表示差異顯著，P＜0.01時表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度變化對脊尾白蝦酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶（ACP）活性隨溫度變化的情況如圖1所示。與對照組相比，在25～10℃溫度下降階段，ACP活性呈升高趨勢，至10℃時達到峰值，隨后開始下降；雖然從5℃升高至10℃時其活性略有上升，但隨后便迅速下降到和對照組相同的活性水平。t－test檢驗表明，溫度變化后的活性水平與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

圖1 溫度變化下的酸性磷酸酶（ACP）活性Fig.1 Changing of ACP activity in response to different temperature stress

2.2 溫度變化對脊尾白蝦堿性磷酸酶活性的影響

堿性磷酸酶（AKP）活性隨溫度變化的情況如圖2所示。與酸性磷酸酶在溫度下降階段的活性變化情況相比，在25～5℃溫度下降階段，AKP活性則呈下降趨勢，至5℃時達到最低值；隨后隨溫度上升AKP活性開始增強，在20℃時恢復到對照組活性水平。t－test檢驗表明，溫度變化后的活性水平與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 溫度變化下的堿性磷酸酶（AKP）活性Fig.2 Changing of AKP activity in response to different temperature stress

2.3 溫度變化對脊尾白蝦過氧化氫濃度的影響

過氧化氫（H2O2）濃度隨溫度變化的情況如圖3所示。在25～5℃溫度下降階段，過氧化氫（H2O2）濃度為平穩(wěn)中略有上升；在5～15℃溫度上升階段，過氧化氫（H2O2）濃度迅速升高，隨后隨著溫度進一步升高，則又迅速下降，至20℃時恢復到對照組的濃度水平。t－test檢驗表明，溫度變化后的活性水平與對照組相比，總體差異不顯著（P＞0.05），但在5～15℃溫度上升階段，呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖3 溫度變化下的過氧化氫（H2O2）濃度Fig.3 Changing of H2O2content in response to different temperature stress

2.4 溫度變化對脊尾白蝦過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD）活性隨溫度變化的情況如圖4所示。在25～5℃溫度下降階段，過氧化物酶（POD）活性高于對照組，但差異并不顯著（P＞0.05）；在5～15℃溫度上升階段，過氧化物酶（POD）活性迅速升高并在15℃時達到峰值，隨后隨著溫度進一步升高，則又迅速下降。t－test檢驗表明，溫度變化后的過氧化物酶活性水平與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

圖4 溫度變化下的過氧化物酶（POD）活性Fig.4 Changing of POD activity in response to different temperature stress

2.5 溫度變化對脊尾白蝦總抗氧化能力的影響

總抗氧化能力（T－AOC）隨溫度變化的情況如圖5所示。在25～10℃溫度下降階段，總抗氧化能力（T－AOC）呈上升趨勢，隨后在10～5℃溫度下降期間，活性降低；而在5～10℃溫度升高階段活性又升高，隨后10～25℃溫度升高階段則呈下降趨勢，在恢復到25℃時，總抗氧化能力（T－AOC）值甚至低于對照組。t－test檢驗表明，溫度變化后的總抗氧化能力（T－AOC）值與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）。

圖5 溫度變化下的總抗氧化能力（T－AOC）Fig.5 Changing of T－AOC value in response to different temperature stress

3 討論

溫度是影響生物生存和生長的最重要因素之一，尤其是對于屬于變溫動物的蝦類生物影響更大。已有的研究表明，水溫對生物機體內(nèi)自由基水平及其抗氧化防御體系有著顯著的影響［5］，溫差的急劇變化可造成機體自由基代謝紊亂，而大量的自由基在體內(nèi)積累后會損害機體細胞和組織正常的生理機能和免疫防御能力［6］。因此，本研究選擇了酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、總抗氧化能力（TAOC）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫（H2O2）的活性或濃度等與氧化還原系統(tǒng)相關(guān)的指標來考察脊尾白蝦在溫度變化情況下的生理反應。

酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）都廣泛存在于甲殼動物體內(nèi)，作為巨噬細胞溶酶體酶的重要組成部分［7］，是一種對底物專一性較低的磷酸單酯水解酶，參與機體內(nèi)磷酸基團轉(zhuǎn)移和代謝［8］，因此它們也是與能量代謝相關(guān)的酶類。本研究中，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性在溫度下降階段正好相反，酸性磷酸酶呈上升趨勢，而堿性磷酸酶則呈下降趨勢。溫度下降階段酸性磷酸酶活性上升，說明該酶所催化的反應增強，這可能與溫度下降階段脊尾白蝦需要更多的能量來應答環(huán)境變化有關(guān)，而溫度上升階段該酶活性下降也印證了這一推斷。至于堿性磷酸酶，可能與酸性磷酸酶在體內(nèi)的作用正好相反。

機體內(nèi)的過氧化氫（H2O2）是一種對生物機體有害的物質(zhì)，其可以形成活性氧，對機體產(chǎn)生危害［9］。本研究中，過氧化氫濃度在溫度下降階段變化不明顯，而在溫度從5℃起始升高階段表達量則顯著升高，這說明溫度降低不會促使體內(nèi)的氧化自由基增多，而溫度升高則會顯著促使此類氧化物質(zhì)增加，而這也與抗氧化的POD酶活性的變化相一致。POD在生物體內(nèi)主要起催化分解氧化物或過氧化物的作用［10］，屬于抗氧化酶類。本研究中，該酶在溫度下降階段，其活性變化雖然略呈升高狀態(tài)，但是變化并不顯著，在從5℃起始升高階段表達量則顯著升高，說明體內(nèi)產(chǎn)生了大量的氧化自由基，機體為消除這些有害物質(zhì)，而提高了抗氧化酶類的表達量，而且比較H2O2濃度和POD活性的變化曲線可以發(fā)現(xiàn)，二者具有一致性，說明二者間可能存在著內(nèi)在的聯(lián)系。

總抗氧化能力（T－AOC）可以代表體內(nèi)各種抗氧化物的總體水平［11］。在溫度下降階段，脊尾白蝦中的T－AOC活性逐步升高，在溫度上升階段又再一次升高并隨后下降。這說明無論溫度降低或升高的環(huán)境變化都可能導致機體內(nèi)產(chǎn)生氧化自由基，并使機體作出相應的生理應答反應，提高抗氧化能力的水平。

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