田洪艷 李質(zhì)馨徐 冶 潘曉燕 王弘珺 劉忠平 林冬靜

吉林醫(yī)藥學院組織學與胚胎學教研室（吉林 132013）

蒺藜提取物對小鼠睪丸熱損傷后NOS-NO系統(tǒng)的影響*

田洪艷 李質(zhì)馨**徐 冶 潘曉燕 王弘珺 劉忠平 林冬靜

吉林醫(yī)藥學院組織學與胚胎學教研室（吉林 132013）

目的觀察蒺藜提取物對小鼠熱損傷睪丸一氧化氮合酶（NOS）-一氧化氮（NO）系統(tǒng)的影響，探討蒺藜對小鼠熱損傷睪丸的保護修復作用機制。方法健康雄性小鼠30只，隨機分為對照組、模型組和給藥組，每組10只；建立睪丸熱損傷模型，給予治療劑量的蒺藜提取物；睪丸NOS活力和NO含量測定；睪丸NOS 和caspase-3免疫組織化學染色，光學顯微鏡觀察；酶聯(lián)法檢測血清中睪酮含量。結果模型組與對照組相比睪丸組織NOS活力和NO含量明顯升高，睪丸iNOS陽性表達明顯增加，睪丸caspase-3陽性細胞明顯增多，血清睪酮含量明顯降低。給藥組與模型組相比睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達明顯減少，睪丸caspase-3陽性細胞明顯減少，血清睪酮含量明顯升高。結論 蒺藜提取物通過調(diào)控NOS-NO系統(tǒng)，實現(xiàn)對小鼠熱損傷睪丸的保護修復作用。

蒺藜; 熱損傷; 睪丸; 一氧化氮合酶; 一氧化氮

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種具有廣泛生物學效應的氣體信號分子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應生成，可由多種類型的細胞產(chǎn)生。NO以自分泌和旁分泌形式作用于組織細胞，參與機體多種生理和病理反應過程[1,2]。NO的生物半衰期僅數(shù)秒,因此細胞產(chǎn)生NO量的多少關鍵取決于NOS的活性。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)3種亞型NOS，即神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）、誘導型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）。NO在生殖系統(tǒng)中的作用已被廣大學者所關注，研究表明NO與陰莖勃起、睪丸微循環(huán)調(diào)節(jié)、雄激素分泌、精子成熟、運動及獲能等生殖活動均有密切關系[3-6]。中醫(yī)學指出蒺藜具有促進精子產(chǎn)生、提高生殖能力等作用，但這僅限于中醫(yī)臨床觀察，且只是表征的描述。本文是從睪丸NOS-NO系統(tǒng)的變化，探討蒺藜提取物對小鼠熱損傷睪丸的保護修復作用機制。

材料和方法

一、材料

（一）實驗動物和分組

選用健康清潔級ICR雄性小鼠，30只，體質(zhì)量（25±2）g，購自吉林大學動物實驗中心。將30只小鼠隨機分為對照組、模型組和給藥組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為18～22℃，相對濕度45%～55%，規(guī)律光照，自由飲食，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

（二）主要試劑與儀器

蒺藜提取物，棕黃色粉末，陜西森弗生物技術有限公司；多聚甲醛，國藥集團化學試劑有限公司；NOS測定試劑盒、NO測試盒和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；睪酮（testosterone，T）ELISA檢測試劑盒，美國；兔抗鼠iNOS多克隆抗體、兔抗鼠caspase-3多克隆抗體、SABC免疫組織化學染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。三用恒溫水箱，上海精宏實驗設備有限公司；TDZ5-WS型離心機，長沙湘儀離心機有限公司；MK3型酶標儀，美國熱電公司；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；微量電動勻漿器，美國kimble公司；Leica-RM2245石蠟切片機，德國；OLYMPUS-DP71數(shù)碼顯微鏡，日本。

二、方法

（一）建立動物模型

小鼠均用0.4%戊巴比妥鈉0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉。熱處理參照Lue等方法[7]，模型組和給藥組小鼠麻醉后，陰囊浸于43℃恒溫水浴中，20min；對照組小鼠麻醉后，陰囊浸于22℃恒溫水浴中，20min。各組均于熱處理前4天開始灌胃，每天1次；給藥組灌服蒺藜提取物，390mg/kg；對照組和模型組灌服等量的蒸餾水；連續(xù)灌胃至熱處理后3d，取材進行標本制備。

（二）血清T含量測定

0.4%戊巴比妥鈉0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉；心臟穿刺取血；分離血清；酶聯(lián)法檢測血清中T含量，檢測方法按照試劑盒說明書進行。

（三）睪丸NOS活力和NO含量測定

處死小鼠，立即取睪丸，經(jīng)預冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，除去皮下脂肪和其他結締組織，稱量；量取該組織塊9倍質(zhì)量的預冷生理鹽水，用微量電動勻漿器制成10%組織勻漿；反復凍融3次，使細胞完全破碎，內(nèi)容物完全游離在液相中；離心，取上清液；測定NOS活力和NO含量，測定方法按照試劑盒說明書進行。

（四）NOS免疫組織化學染色

取睪丸，放入4%多聚甲醛中固定；常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋；石蠟切片機切片，5μm。釆用SABC法進行iNOS免疫組織化學染色。染色步驟按試劑盒說明書進行，用正常非免疫血清代替一抗作替代對照，用不加一抗的緩沖液作空白對照，DAB顯色，蘇木精復染，光學顯微鏡下觀察。iNOS免疫組織化學染色陽性表達產(chǎn)物呈棕黃色，定位于細胞質(zhì)。用Image-Pro Plus分析軟件對iNOS的表達進行定量分析，每組隨機選取30個視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度。

（五）caspase-3免疫組織化學染色

石蠟切片制作同上，釆用SABC法進行caspase-3免疫組織化學染色。染色步驟按試劑盒說明書進行，用正常非免疫血清代替一抗作替代對照，用不加一抗的緩沖液作空白對照， DAB顯色，光學顯微鏡下觀察，caspase-3陽性細胞呈棕黃色。每組隨機選取30個視野（×200），計數(shù)caspase-3陽性細胞數(shù)。

三、統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行實驗結果的差異性檢驗，分析前進行方差齊性檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、睪丸NOS活力的變化

對照組睪丸組織NOS活力為（1.337±0.057）U/mg prot；模型組睪丸組織NOS活力為（2.370± 0.065）U/mg prot，與對照組比較活力明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；給藥組睪丸組織NOS活力為（1.547±0.052）U/mg prot，與模型組比較活力明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

二、睪丸NO含量的變化

對照組睪丸組織NO含量為（3.192±0.067）μmol/g prot；模型組睪丸組織NO含量為（4.272± 0.073）μmol/g prot，與對照組比較含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；給藥組睪丸組織NO含量為（3.377±0.071）μmol/g prot，與模型組比較含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

三、睪丸iNOS陽性細胞的表達

睪丸iNOS陽性細胞為多邊形，核圓居中，胞質(zhì)呈棕黃色，主要分布于睪丸間質(zhì)（圖1）。對照組iNOS陽性細胞數(shù)量少，胞質(zhì)顯色淡，iNOS陽性反應的平均光密度為0.1386±0.0076；模型組iNOS陽性細胞數(shù)量增多，胞質(zhì)顯色較深，iNOS陽性反應的平均光密度為0.2173±0.0145，明顯高于對照組（P＜0.01）；給藥組iNOS陽性細胞數(shù)量減少，胞質(zhì)顯色較淡，iNOS陽性反應的平均光密度為0.1637± 0.0073，明顯低于模型組（P＜0.01）。

四、睪丸caspase-3陽性細胞的變化

caspase-3陽性細胞呈棕黃色，主要分布于生精細胞（圖2）。對照組caspase-3陽性細胞少，caspase-3陽性細胞數(shù)為1.167±0.986；模型組caspase-3陽性細胞增多，caspase-3陽性細胞數(shù)為9.433±1.775，明顯高于對照組（P＜0.01）；給藥組caspase-3陽性細胞減少，caspase-3陽性細胞數(shù)為3.133±1.196，明顯低于模型組（P＜0.01）。

五、血清T含量的變化

對照組血清T含量為（1.926±0.056）ng/mL；模型組血清T含量為（1.298±0.052）ng/mL，與對照組比較含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；給藥組血清T含量為（1.803±0.072）ng/mL，與模型組比較含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠睪丸iNOS陽性細胞（SABC法）

圖2 各組小鼠睪丸caspase-3陽性細胞（SABC法）

討 論

NO一方面作為一種信使分子參與體內(nèi)的各種重要生理功能[1]；另一方面NO還是一種細胞毒性分子，可造成組織細胞損傷，過多的NO生成與某些疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[8]。NO具有良好的親脂性，可快速通過細胞膜擴散，到達鄰近靶細胞發(fā)揮作用。NO在體內(nèi)的作用，可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶（GC），使環(huán)鳥甘酸（cGMP）升高而完成；也可以與體內(nèi)眾多生物分子直接發(fā)生反應而參與，這時不依賴cGMP。機體對NO作用的調(diào)節(jié)主要是通過對NOS的調(diào)控來實現(xiàn)，NOS是唯一催化NO合成的酶分子，目前已純化了3種同工酶（nNOS、iNOS，eNOS），從功能上可把NOS分為結構型（nNOS、eNOS）和誘導型（iNOS）兩種。nNOS和eNOS是通過機體對Ca2+水平的控制而低水平持續(xù)表達，使NO維持在低濃度發(fā)揮生理功能；iNOS可通過誘導合成，一旦合成即產(chǎn)生大量NO。iNOS是引起體內(nèi)NO過量產(chǎn)生的主要基礎，大量NO可以造成組織和細胞的損害甚至死亡，所以iNOS的誘導合成就成為眾多疾病的發(fā)病關鍵[8]。NO對雄性生殖功能亦具有重要的調(diào)節(jié)作用，與男性不育有著密切的關系。因此，近年來對NO的研究越來越受到廣大生殖醫(yī)學工作者的重視[3-6]。在我們的實驗中觀察到模型組與對照組相比NOS活力和NO含量明顯升高，睪丸iNOS陽性表達增加；給藥組與模型組相比NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達明顯減少；表明蒺藜提取物可通過調(diào)控睪丸組織NOS-NO系統(tǒng)，實現(xiàn)對小鼠熱損傷睪丸的保護修復作用。

細胞凋亡是細胞在一定的生理和病理條件下，遵循自身的程序自己結束生命的過程。細胞凋亡不僅參與生物體的生長發(fā)育，也介導了一些疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，生精細胞凋亡的研究已成為一個熱點，尤其是對不育癥的研究也給予了較多關注[9,10]。隨著細胞凋亡機制和調(diào)控的闡明，將有助于探討生精細胞凋亡與男性不育的關系。研究表明NOS和NO參與睪丸組織細胞的分化和凋亡的調(diào)控，NOS缺乏或NOS表達增強可以減少或增加細胞凋亡[11,12]。高濃度的NO是一種重要的凋亡誘導因子。NO可直接損傷細胞的DNA，誘導細胞凋亡；NO與O2-?結合生成ONOO-，后者可直接或通過分解成許多小分子毒性物質(zhì)損傷細胞，從而誘導細胞凋亡；NO可影響多種凋亡相關基因而誘導凋亡。caspase-3是細胞凋亡過程中最關鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細胞凋亡過程中的許多關鍵蛋白，caspase-3的激活常被作為細胞凋亡的一個重要指標。在我們的實驗中觀察到模型組與對照組相比，caspase-3陽性細胞明顯增多，同時睪丸組織NOS活力和NO含量顯著增高，睪丸iNOS陽性表達增加；給藥組與模型組相比，caspase-3陽性細胞明顯減少，同時睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達明顯減少；表明蒺藜提取物可通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)控睪丸生殖細胞的凋亡。

精子發(fā)生是一個高度復雜的細胞分裂分化過程，并且易受到許多內(nèi)、外源性致病因素的影響[13,14]。睪丸各細胞間存在著復雜的旁分泌調(diào)節(jié)機制，許多細胞還有自分泌調(diào)節(jié)功能。睪丸生精上皮中的生精細胞是在許多旁分泌因子及自分泌因子形成的局部激素環(huán)境中進行增殖、分裂和分化的。睪酮是啟動和維持精子發(fā)生的最重要激素，睪酮形成后被動擴散入生精上皮，與雄激素結合蛋白結合，促進精子發(fā)生。研究結果證實，睪酮分泌與NO關系密切，NO對睪酮的分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用。NO在低濃度時可以通過cGMP介導作用刺激睪酮的分泌，在高濃度時則抑制睪酮的分泌[15]。在我們的實驗中觀察到模型組與對照組比較，小鼠血清T含量明顯降低，同時睪丸組織NOS活力和NO含量顯著增高，睪丸iNOS陽性表達增加；給藥組與模型組比較，小鼠血T含量明顯升高，同時睪丸組織NOS活力和NO含量明顯降低，睪丸iNOS陽性表達明顯減少；表明蒺藜提取物可通過NOS-NO系統(tǒng)調(diào)控T的分泌，進而調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。

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11 Lue Y, Sinha Hikim AP, Wang C,et al. Functional role of inducible nitric oxide synthase in the induction of male germ cell apoptosis, regulation of sperm number, and determination of testes size: evidence from null mutant mice.Endocrinology2003; 144(7):3092-3100

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14 Paul C, Teng S, Saunders PT. A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death.Biol Reprod2009; 80(5): 913-919

15 Valenti S, Cuttica CM, Fazzuoli L,et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purif ed rat Leydig cells cultured in vitro.Int J Androl1999; 22(5): 336-341

（2014-09-15收稿）

Effects of tribulus terrestris extract on the nos-no system of the thermal-injured testis in mice*

Tian Hongyan, Li Zhixin**, Xu Ye, Pan Xiaoyan,Wang Hongjun, Liu Zhongping, Lin Dongjing
Department of Histology and Embryology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China

Li Zhixin, E-mail: lzx-62@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Tribulus Terrestris extract on the NOS-NO system of the thermalinjured testis in mice, and explore its mechanism.MethodsAll 30 healthy male mice were randomly divided into the control group, the model group and the treated group, 10 mice per group. The thermal-injured testis models of mice were established and then were administrated with dose of Tribulus terrestris extract. NOS activity and NO content of the testis were measured. Levels of testicular NOS and Caspase-3 were detected by immunohistochemistry. The content of testosterone in serum was detected by ELISA.ResultsCompared with that of the control group, activities of NOS and the content of NO in testicular tissues were increased signif cantly in the model group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also increased obviously, but the serum concentration of testosterone was decreased. Compared with that of the model group, activities of NOS and the content of NO of the testicular tissue were decreased in the treated group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also decreased signif cantly, but the serum concentration of testosterone was increased.ConclusionTribulus terrestris extract shows protect effects on the thermal-injuried testis in mice by regulating the NOS-NO system.

tribulus terrestris; thermal injuries; testis; nitric oxide synthase; nitric oxide

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.003

R 329.464; R 594.1

資助: 吉林省教育廳科學技術研究項目資助（2012484，2012485，2013477）;吉林省衛(wèi)生廳科技計劃資助項目（2012年）
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, E-mail: lzx-62@163.com