易 帥，霍曉川，甄 為，羅俊生

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001

基礎(chǔ)研究

Toll樣受體4拮抗劑防治兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)型血管痙攣

易 帥，霍曉川，甄 為，羅俊生

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001

目的探討Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)拮抗劑依立托侖四鈉(E5564)防治蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)后遲發(fā)性腦血管痙攣(delayed cerebral vasospasm，DCV)的作用。方法新西蘭大白兔60只隨機(jī)分為3組，每組20只。模型組枕大池二次注血法建立SAH模型。對(duì)照組枕大池內(nèi)注入0.9%氯化鈉注射液。E5564組SAH模型建立后，E5564靜脈給藥。血管造影及經(jīng)顱多普勒評(píng)估血管痙攣情況，造模后第7天取材，HE染色觀察基底動(dòng)脈痙攣情況。免疫組化和Western blot方法檢測(cè)基底動(dòng)脈Toll受體4的表達(dá)。結(jié)果SAH后血管痙攣模型造模成功，模型組與對(duì)照組比較基底動(dòng)脈直徑明顯降低(P＜0.01)；E5564組基底動(dòng)脈直徑較模型組明顯增加(P＜0.01)；免疫組化及Western blot顯示E5564組基底動(dòng)脈TLR4表達(dá)較SAH組明顯減少(P＜0.05)。結(jié)論蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)型腦血管痙攣可能與Toll樣受體4信號(hào)通路有關(guān)，E5564可以明顯降低SAH后基底動(dòng)脈TLR4表達(dá)，緩解SAH后遲發(fā)型腦血管痙攣。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；遲發(fā)型腦血管痙攣；Toll樣受體4；依立托侖四鈉；IL-8；兔

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神經(jīng)外科常見(jiàn)病，其致殘率、致死率較高，預(yù)后不良的主要原因是遲發(fā)性腦血管痙攣[1]。SAH引起腦血管痙攣的機(jī)制復(fù)雜，目前仍缺少有效的方法來(lái)控制，SAH后腦血管痙攣的病理機(jī)制仍然不清楚，有待進(jìn)一步研究[2-3]。有關(guān)研究表明炎癥反應(yīng)是蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣的重要環(huán)節(jié)。Toll樣受體4是發(fā)現(xiàn)最早的Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)亞型之一，由于TLR4在識(shí)別細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用，其在炎癥相關(guān)疾病中的作用受到強(qiáng)烈關(guān)注[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制兔SAH模型，觀察TLR4對(duì)兔SAH后腦血管痙攣的影響，以探討TLR4信號(hào)通路在SAH后腦血管痙攣中的作用，尋求SAH后腦血管痙攣治療的新途徑。

材料和方法

1 動(dòng)物與分組 取新西蘭純種健康清潔級(jí)大白兔60只，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，4 ～ 6個(gè)月月齡，體質(zhì)量2.5 ～ 3.0 kg。隨機(jī)分為對(duì)照組(枕大池注入0.9%氯化鈉注射液0.5 ml/kg，n=20)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(n=20)和依立托侖四鈉(E5564)組(n=20)。

2 兔SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣(delayed cerebral vasospasm，DCV)模型的制作 采用枕大池二次注血法制備兔蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。3%硫噴妥鈉經(jīng)兔耳緣靜脈(1 mg/kg)麻醉動(dòng)物，麻醉成功后，將其俯臥于兔臺(tái)上，剪掉頸枕部體毛，暴露枕大池。碘伏局部皮膚消毒，皮試針小心刺破硬膜，有突破感后再將針頭繼續(xù)深入1 ～ 2 mm，緩慢向回抽取1 ml的腦脊液后，再按0.18 ml/kg從兔耳中央動(dòng)脈快速抽取動(dòng)脈血，并慢慢注射入枕大池，3 min內(nèi)注完。將兔保持頭低位30° 30 min，以避免蛛網(wǎng)膜下腔血液擴(kuò)散速度太快，盡量積聚在基底池附近。用0.9%氯化鈉注射液稀釋的慶大霉素沖洗傷口后加壓包扎。48 h后重復(fù)上述操作完枕大池二次注血。給藥組每次枕大池注血后立即靜脈注射E5564 1次，劑量為1.5 mg/kg[5]對(duì)照組操作同SAH組，但注入的是0.9%氯化鈉注射液。

3 神經(jīng)功能評(píng)分 觀察建模后7 d內(nèi)神經(jīng)缺損癥狀進(jìn)行功能性評(píng)分。按Endo標(biāo)準(zhǔn)[6]將兔神經(jīng)功能缺損癥狀分為4級(jí)：1級(jí)無(wú)神經(jīng)功能缺損，評(píng)0分；2級(jí)輕度或者可疑神經(jīng)功能缺損(嗜睡活動(dòng)減少)，評(píng)1分；3級(jí)中度神經(jīng)功能缺損(肢體無(wú)力跛行)，評(píng)2分；4級(jí)重度神經(jīng)功能缺損(劃圈運(yùn)動(dòng)或行走困難)評(píng)3分。

4 經(jīng)顱多普勒(transcranial doppler，TCD)分析 為了避免造影劑的干擾，在第3天血管造影之前進(jìn)行經(jīng)顱多普勒超聲。脈沖4-MHz探頭，以一定的角度置于兔子頭部，直到發(fā)現(xiàn)最清晰的血液信號(hào)。記錄基底動(dòng)脈的平均血流速度(mean flow velocity，MFV)和收縮期峰值流速(peak systolic velocity，PSV)。

5 血管造影分析 3%的硫噴妥鈉(1 ml/kg)注入耳緣靜脈麻醉。然后讓兔子取仰臥位，用5-F導(dǎo)管通過(guò)股動(dòng)脈插入到主動(dòng)脈弓。再注入5 ml照影劑(三碘三酰苯)，2 min內(nèi)注完。采圖速率為6張/min。分析軟件處理血管造影片。選取5點(diǎn)(在基底動(dòng)脈中心點(diǎn)，距離中心點(diǎn)1 mm處，距離中心點(diǎn)2 mm處)對(duì)基底動(dòng)脈管徑進(jìn)行測(cè)量。計(jì)算出5點(diǎn)的平均直徑。所有血管造影片為同一個(gè)研究員采集，基底動(dòng)脈直徑通過(guò)盲法測(cè)定。血管造影分別在造模前(T1)，造模后第3天(T2)和第7天(T3)執(zhí)行。

6 標(biāo)本采集及病理 造模成功后第7天，在麻醉狀態(tài)下將其處死，原位灌注兔后留取基底動(dòng)脈，取基底動(dòng)脈1/2段行蘇木精-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，光鏡檢查。

7 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片脫蠟至水，微波修復(fù)抗原后，滴加5%山羊血清封閉液，適量PBS稀釋的一抗(兔抗TLR4和IL-8，1∶100稀釋)，-4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜(或37℃2 h左右)。然后加入加生物素化山羊抗兔IgG，37℃恒溫箱內(nèi)孵育20 min。進(jìn)行DAB顯色。染色后的切片放在顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)或胞核顯現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，未顯現(xiàn)棕黃色記為陰性。陰性反應(yīng)組用DPS緩沖液代替一抗。用IPP軟件觀察和分析每個(gè)組織點(diǎn)的5個(gè)隨機(jī)視野。染色范圍被分為4級(jí)：+染色范圍小于1/4視野；++染色范圍在1/4到1/2視野；+++染色范圍在1/2到3/4視野；++++染色范圍大于3/4視野。分為4個(gè)染色等級(jí)：弱陽(yáng)性(+)，中等陽(yáng)性(++)，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。染色范圍和染色等級(jí)被轉(zhuǎn)換成染色指數(shù)。染色指數(shù)=染色范圍×染色等級(jí)。+為1分，++為2分，+++為3分，++++為4分。

8 Western blot檢測(cè)TLR4和IL-8表達(dá)水平 制作基底動(dòng)脈組織蛋白勻漿，用蛋白裂解液進(jìn)行凝膠電泳，將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素薄膜上，用TBST浸洗，加入封閉液體對(duì)其進(jìn)行封閉，與一定比例稀釋的一抗混合孵育。TBST浸洗后與二抗室溫混合孵育。TBST再次浸洗后加入發(fā)光顯色劑進(jìn)行顯色。條帶光密度應(yīng)用JD801圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 Endo神經(jīng)功能評(píng)分 對(duì)照組術(shù)后未見(jiàn)神經(jīng)功能異常評(píng)0分。SHA組(2.3±0.71)分，E5564組(1.4±0.21)分，E5564組與SHA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 TCD檢測(cè) SAH組與對(duì)照組相比，平均MFV和PSV明顯升高(P＜0.05)。E5564組與SAH組相比平均MFV和PSV明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

3 基底動(dòng)脈直徑 SAH組和E5564組基底動(dòng)脈平均管徑在T2和T3較對(duì)照組基底動(dòng)脈平均管徑明顯減小，SAH組基底動(dòng)脈平均管徑較E5564組減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，E5564明顯抑制了腦出血后的血管痙攣，見(jiàn)表1。

4 HE染色 SAH組血管明顯痙攣，管壁增厚，內(nèi)膜皺褶，部分基底膜斷裂，明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組血管痙攣和炎癥反應(yīng)輕，見(jiàn)圖2。

5 免疫組化 與對(duì)照組相比SHA組TLR4和IL-8表達(dá)水平明顯增高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與SHA組相比E5564組TLR4和IL-8表達(dá)水平明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

6 Western blot檢測(cè) 與對(duì)照組比較SAH組的TLR4和IL-8表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)；與SAH組相比E5564組的TLR4和IL-8表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖3，圖4，表3。

表1 基底動(dòng)脈直徑Tab. 1 Diameter of basilar artery(mm)

表2 TLR4和IL-8的免疫組化檢測(cè)(染色指數(shù))Tab. 2 Immunohistochemistry showing expression of TLR4 and IL-8

表3 基底動(dòng)脈TLR4和IL-8蛋白表達(dá)(光密度比)Tab. 3 Expression of TLR4 and IL-8 protein in basilar artery

討 論

我們所用的Chan所創(chuàng)立的家兔二次枕大池注血模型已成為研究腦血管痙攣發(fā)生機(jī)制的常用動(dòng)物模型[7]。此模型的腦血管痙攣程度能經(jīng)血管造影證實(shí)，而且其形態(tài)學(xué)改變也與人極為相似。本實(shí)驗(yàn)在第一次注血7 d后將大鼠處死，觀察到SAH組和E5564組動(dòng)物基底池和基底動(dòng)脈周?chē)猩倭垦獕K聚積。實(shí)驗(yàn)中SAH組大鼠的基底動(dòng)脈直徑較對(duì)照組明顯減小(P＜0.01)，說(shuō)明模型反應(yīng)良好。

Toll樣受體屬于模式識(shí)別受體，它在炎癥反應(yīng)和固有免疫起著關(guān)鍵性的作用。13種哺乳動(dòng)物的TLR已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中11種在人類(lèi)被發(fā)現(xiàn)。它們識(shí)別來(lái)自不用器官的病原分子模式，包括細(xì)菌病毒，真菌，分枝桿菌和寄生蟲(chóng)[8]。此外TLR還識(shí)別破壞相關(guān)分子模式并且中介主要的損傷性炎癥反應(yīng)。TLR存在一類(lèi)胞外區(qū)含有許多亮氨酸高度重復(fù)序列，并且其胞內(nèi)區(qū)與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)同源，該胞內(nèi)區(qū)稱(chēng)為T(mén)IR(TIRIL-R1 homologous region)區(qū)的跨膜受體。TLR可通過(guò)依賴(lài)接頭分子髓系分化因子88(myloid differentiation factor 88，MyD88)和非依賴(lài)的含有TIR結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)干擾素β的接頭分子(domain containing adaptor inducing interferon，TRIF)兩類(lèi)信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)[9]。通過(guò)白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中介產(chǎn)物)家族成員的聚集來(lái)激活TLR信號(hào)從而活化核因子NF-κB，而后者是激活型I型干擾素的轉(zhuǎn)錄，從而觸發(fā)下游的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路包括依賴(lài)MyD88及非依賴(lài)MyD88的兩種途徑。我們研究發(fā)現(xiàn)SAH組TLR4在腦基底動(dòng)脈表達(dá)明顯增高，這提示腦血管痙攣有可能是通過(guò)TLR4介導(dǎo)的。

據(jù)報(bào)道在鼠顱內(nèi)出血模型中TLR4被內(nèi)在的配體，例如腦出血后產(chǎn)生的亞鐵血紅素和纖維蛋白原等活化上調(diào)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAH組的TLR4和IL-8的表達(dá)都高于對(duì)照組，說(shuō)明腦出血后可能產(chǎn)生某種或某類(lèi)配體，這些配體與TLR4結(jié)合介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)使IL-8高表達(dá)，IL-8可能參與腦血管痙攣的發(fā)生。

依立托侖四鈉是TLR4的特異性拮抗劑，它是一種合成型的脂質(zhì)-A類(lèi)似物，能拮抗LPS的生理生化活性，阻止NF-κB的轉(zhuǎn)移[11]。研究表明，E5564對(duì)患有膿毒血癥的鼠有治療作用，能降低血壓并且修復(fù)血管。Shimamoto等已經(jīng)證明，E5564預(yù)治療能降低梗死面積。國(guó)外已有其在心臟，肺方面的研究[12]。目前已安全用于敗血癥的治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中心肌保護(hù)等方面[13-14]。

據(jù)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，腦血管痙攣導(dǎo)致炎癥滲出，腦水腫和細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致血腦屏障的破壞和大量腦細(xì)胞死亡[15-16]。所以我們采用靜脈注射E5564觀察其對(duì)腦血管痙攣的影響，E5564組在給藥后第5天時(shí)抑制血管痙攣?zhàn)蠲黠@，5 d后效果不顯著，這可能與SAH后血腦屏障的自行修復(fù)或腦啟動(dòng)某種血管保護(hù)機(jī)制有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E5564組的TLR4和IL-8的表達(dá)水平明顯下降，這可能與E5564抑制TLR4受體，減少下游IL-8的表達(dá)有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了TLR4信號(hào)通路在腦血管痙攣中的重要地位。通過(guò)抑制TLR4通路可以有效地抑制腦血管痙攣。這可能與IL-8的表達(dá)降低有關(guān)系。

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Effect of Toll-like receptor 4 inhibitor on delayed cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage

YI Shuai, HUO Xiao-chuan, ZHEN Wei, LUO Jun-sheng
Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China Corresponding author: LUO Jun-sheng. Email: luojunshengljs@sina.com

ObjectiveTo study the effect of Toll-like receptor 4 (TLR4) inhibitor E5564 on delayed cerebral vasospasm (DCV) following subarachnoid hemorrhage (SAH). MethodsSixty New Zealand rabbits were randomly divided into SAH model group, control group and E5564 group (20 in each group). Blood was injected into the animal cisterna magna of SAH model group, saline was injected into the animal cisterna magna of control group, and E5546 was injected into the animal vein of E5564 group after the SAH model was established. DCV was assessed by angiography and TCD, respectively. Basilar artery spasm was observed with HE staining 7 days after the SAH model was established. Expression of TLR4 in basilar artery was detected by immunohistochemistry and Western blot, respectively. ResultsThe diameter of basilar artery was significantly shorter in SAH model group than in control group and signifcantly longer in E5564 group than in SAH model group (P＜0.01). Immunohistochemistry and Western blot showed that the expression level of TLR4 in basilar artery was significantly lower in E5564 group than in SAH model group (P＜0.05). ConclusionDCV following SAH may be associated with the TLR4 signal pathway. E5564 can signifcantly inhibit the expression of TLR-4 in basilar artery, thus alleviating DCV following SAH.

subarachnoid hemorrhage; delayed cerebral vasospasm; Toll-like receptor 4; E5564; IL-8; rabbits

R 743.35

A

2095-5227(2014)02-0157-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.018

2013-11-13 11:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131113.1151.001.html

2013-09-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171111)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013022016)；遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(L2012298)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目(XZJJ20130211)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171111); Liaoning Natural Science Foundation of China(2013022016)

易帥，在讀碩士。研究方向：腦血管病的基礎(chǔ)研究。Email: 286649706@qq.com

羅俊生，博士后，教授，博士生導(dǎo)師。Email: luojunsheng ljs@sina.com