雷英英，段連寧，羅 淵，郭廣進(jìn)，許鵬飛，陸承榮，王 喆，向培德

1空軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100142；2河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000

非清髓單倍體相合骨髓移植后自然殺傷細(xì)胞參與急性移植物抗宿主病的免疫病理學(xué)研究

雷英英1,2，段連寧1，羅 淵1，郭廣進(jìn)1，許鵬飛1，陸承榮1，王 喆1，向培德1

1空軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100142；2河北北方學(xué)院研究生部，河北張家口 075000

目的 研究自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞在非清髓單倍體相合骨髓移植中參與急性移植物抗宿主病(acute graft vs host disease，aGVHD)過程的免疫病理。方法本實(shí)驗(yàn)建立了以C57BL/6小鼠為供鼠、CB6F1小鼠為受鼠的急性移植物抗宿主病模型。觀察小鼠發(fā)生aGVHD的癥狀體征，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠移植后嵌合率及NK細(xì)胞活化受體NKp46表達(dá)強(qiáng)度，免疫熒光染色觀察aGVHD靶器官部位NK細(xì)胞分布。結(jié)果移植鼠aGVHD發(fā)生率80%，移植+15 d達(dá)到完全嵌合，移植+25 d左右小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、聳毛、弓背等典型aGVHD癥狀。發(fā)生aGVHD小鼠外周血NK細(xì)胞NKp46表達(dá)強(qiáng)度低于未發(fā)生aGVHD小鼠，受鼠肝匯管區(qū)有供鼠源NK細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論在非清髓單倍體相合骨髓移植中NK細(xì)胞參與了肝處移植物抗宿主病的病理反應(yīng)，NK細(xì)胞活化受體NKp46表達(dá)強(qiáng)弱與aGVHD的發(fā)生相關(guān)，NKp46表達(dá)強(qiáng)度可能為aGVHD診斷提供依據(jù)。

非清髓單倍體相合骨髓移植；急性移植物抗宿主病；自然殺傷細(xì)胞；NKp46

移植物抗宿主病是影響同種異基因造血干細(xì)胞移植患者生存、復(fù)發(fā)及生活質(zhì)量的主要并發(fā)癥。急性移植物抗宿主病(acute graft vs host disease，aGVHD)主要影響受者肝、皮膚、腸道等臟器功能。減低毒性的預(yù)處理方案既能獲得較好的治療效果又可降低移植相關(guān)毒性，非清髓半相合造血干細(xì)胞移植由于解決了供髓來源問題而擁有良好的臨床治療優(yōu)勢(shì)。NKp46是自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的活化性受體之一，其表達(dá)水平與殺傷活性密切相關(guān)，NK細(xì)胞的活化在多種疾病中發(fā)揮重要作用[1-2]。NK細(xì)胞是同種異基因造血干細(xì)胞移植后首先恢復(fù)的免疫細(xì)胞，NKp46在aGVHD病理損傷方面的機(jī)制尚未見深入研究[3-4]。本研究以小鼠單倍體相合骨髓移植模型為對(duì)象，探討NKp46表達(dá)強(qiáng)度與aGVHD發(fā)生的關(guān)系及NK細(xì)胞在aGVHD靶器官部位的免疫病理。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 供鼠C57BL/6(H-2b，♂)，受鼠CB6F1(Balb/c×C57BL/6，H-2b/d，♀)，8 ～ 12周齡，體質(zhì)量18 ～ 22 g，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于解放軍304醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無菌層流柜SPF環(huán)境中，墊料經(jīng)過60Co照射處理，飼料經(jīng)紫外線消毒處理，飲用過濾除菌水，小鼠飼養(yǎng)5只/籠。

2 主要試劑及儀器 Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3e，Alexa Fluor 647 anti-mouse H-2d，Alexa Fluor 647 mouse IgG2a同型對(duì)照(Biolegend)，Anti-NKp46抗體，PE Rat IgG2a同型對(duì)照(Miltenyi Biotec)，Rabbit Anti-NCR1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Anti-MHC classⅠ抗體(abcam，ab15680)，F(xiàn)ICT記山羊抗大鼠IgG、Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗兔IgG及冷凍切片包埋劑(中杉金橋)，BD FACS lysing solution(溶血素)(BD Bioscience)，F(xiàn)ACA Calibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司。

3 移植預(yù)處理 移植前5 d對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記、稱重，開始飲用含慶大霉素3.2×104U/L和紅霉素250 mg/L過濾除菌水。單次照射組小鼠接受環(huán)磷酰胺200 mg/kg(-2 d、-1 d)腹腔注射及60Co 450 cGy全身照射(0 d)，照射劑量率為133 cGy/min。分次照射組小鼠移植前接受環(huán)磷酰胺200 mg/kg(-1 d)腹腔注射及200 cGy60Co分次全身照射(-2 d、-1 d，兩次照射間隔24 h)，照射劑量率為66 cGy/min，60Co照射源為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院輻射中心。

4 移植物準(zhǔn)備及移植 移植預(yù)處理后的小鼠平均分為3組：對(duì)照組、小劑量脾細(xì)胞移植組、大劑量脾細(xì)胞移植組。脫頸處死C57BL/6供鼠，75%酒精充分浸泡10 min，取脾于200目金屬網(wǎng)充分研磨，制成單細(xì)胞懸液。無菌取股骨脛骨，5 ml注射器連接4#針頭插入骨髓腔1 ～ 2 mm，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗，直至骨髓腔變白，使骨髓細(xì)胞過4#注射器針頭制成單細(xì)胞懸液。移植當(dāng)天CB6F1接受供鼠骨髓細(xì)胞3×107和脾細(xì)胞6×107或1×108尾靜脈注射移植，對(duì)照組小鼠注射等體積0.9%氯化鈉注射液。

5 aGVHD觀察 移植后觀察小鼠發(fā)生aGVHD的癥狀體征：體質(zhì)量下降、活動(dòng)度減低、弓背、聳毛、脫毛，及時(shí)對(duì)小鼠aGVHD程度進(jìn)行評(píng)估。各指標(biāo)按嚴(yán)重程度評(píng)分0 ～ 2分，共10分，評(píng)分＞6分為嚴(yán)重aGVHD。

6 嵌合率及NKp46平均熒光強(qiáng)度值檢測(cè) 移植后15 d、30 d、45 d、60 d經(jīng)小鼠尾靜脈采血100 μl，10 μl肝素抗凝，標(biāo)本均分成2管，實(shí)驗(yàn)管加入CD3-Alexa Fluor 488 1μl、H-2d-Alexa Fluor 647 1 μl和 NKp46-PE 1 μl，對(duì)照管加入H-2d和NKp46同型對(duì)照各1 μl，室溫避光反應(yīng)20 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，室溫避光反應(yīng)10 min，1 500 r/min離心10 min，棄去上清PBS漂洗2次，離心棄上清，加入400 μl PBS后上機(jī)，用Cell Quest software進(jìn)行分析。檢測(cè)H-2d(-)CD3(+)細(xì)胞群在CD3(+)細(xì)胞群中所占比例，即為受鼠移植嵌合率。同時(shí)圈定供鼠和受鼠NK細(xì)胞，測(cè)定其活化受體NKp46平均熒光強(qiáng)度值。

7 病理學(xué)檢查 處死發(fā)生aGVHD的小鼠，采集皮膚、腸道、肝標(biāo)本，甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察病理學(xué)改變。

8 免疫熒光染色 采集發(fā)生aGVHD小鼠的皮膚、腸道、肝標(biāo)本，冷凍切片包埋劑OCT包埋干冰速凍后于-80℃冰箱保存。染色時(shí)將標(biāo)本切為5 μm切片晾干，放入預(yù)冷的丙酮中固定15 min，PBS洗3次，每次5 min。1∶20山羊血清室溫封閉10 min，傾去山羊血清，勿洗，Anti-mouse H-2d一抗(1∶200)、Rabbit Anti-NCR1一抗(1∶400)孵育4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min，孵育二抗Anti-Rabbit IgG-Alexa Fluor 594(1∶500)、Anti-Rat IgG-FITC(1∶100)，37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，封片，熒光顯微鏡觀察，采圖，分析。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 aGVHD小鼠模型的建立60Co 450 cGy(0 d)單次全身照射及環(huán)磷酰胺200 mg/kg(-2 d、-1 d)腹腔注射預(yù)處理的大小劑量移植組小鼠均未發(fā)生aGVHD，對(duì)照組小鼠長(zhǎng)期存活。分次照射組小鼠移植前接受200 cGy60Co分次全身照射(-2 d、-1 d，兩次照射間隔24 h)及環(huán)磷酰胺200 mg/kg(-1 d)腹腔注射，同樣移植供鼠骨髓細(xì)胞3×107和脾細(xì)胞6×107或1×108，11只(共14只)小鼠發(fā)生了aGVHD，嵌合率穩(wěn)定，為本實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的動(dòng)物模型。分次照射組aGVHD嚴(yán)重程度及發(fā)生率在大劑量脾細(xì)胞移植組與相對(duì)小劑量脾細(xì)胞移植組無明顯差異。

2 小鼠體質(zhì)量、白細(xì)胞波動(dòng) 小鼠體質(zhì)量在移植5 d左右降至最低，其后逐漸恢復(fù)，移植鼠較對(duì)照鼠體質(zhì)量低。在移植后45 ～ 50 d移植鼠體質(zhì)量又發(fā)生了一定程度的下降，與aGVHD相關(guān)。移植后小鼠白細(xì)胞也在第5天降至最低，在40 d以后發(fā)生了與aGVHD加重相關(guān)大幅度下降。移植鼠與對(duì)照鼠體質(zhì)量、白細(xì)胞差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖 1 小鼠體質(zhì)量、白細(xì)胞波動(dòng)趨勢(shì)(n=7) LDT： 小劑量移植組；HDT： 大劑量移植組Fig. 1 Body weight and blood picture of mice after transplantation(n=7) LDT: low dose transplantation, HDT: high dose transplantation

圖 3 小鼠移植后嵌合率及NKp46表達(dá)強(qiáng)度 A：移植嵌合率：H-2d(-)CD3(+)細(xì)胞在CD3(+)細(xì)胞中所占的比例；B： NKp46平均熒光強(qiáng)度 H-2d(-)NKp46(+)為供者NK細(xì)胞；C： 供鼠NK細(xì)胞NKp46平均熒光強(qiáng)度值Fig. 3 Chimerism and NKp46 expression in mice after transplantation A: transplantation chimerism rate; B: mean fuorescence intensity of NKp46; C: mean fuorescence intensity of donor NKp46

3 移植鼠aGVHD表現(xiàn) 分次照射組小鼠在移植后第25天左右出現(xiàn)了小鼠體質(zhì)量減輕、聳毛、弓背、活動(dòng)度減低、皮毛不完整等aGVHD典型表現(xiàn)，之后逐漸進(jìn)展，45 ～ 50 d aGVHD癥狀加重。見圖2。

圖 2 典型aGVHD表現(xiàn) A： 活動(dòng)度減低； B： 皮毛完不完整、聳毛； C： 弓背Fig. 2 Reduced activity (A), intact fur and skin (B), hunched posture in aGVHD mice (C)

4 移植嵌合率及NKp46平均熒光強(qiáng)度的監(jiān)測(cè)分次全身照射組大劑量移植組和小劑量移植組小鼠在移植后15 d已達(dá)到完全供者嵌合狀態(tài)，NK細(xì)胞活化受體NKp46平均熒光強(qiáng)度值在小鼠出現(xiàn)aGVHD癥狀后的兩次檢測(cè)中，發(fā)生aGVHD小鼠的NKp46平均熒光強(qiáng)度值均低于未發(fā)生aGVHD小鼠。見圖3。

圖 4 小鼠aGVHD靶器官組織化學(xué)染色 A： 小鼠皮膚； B： 小鼠肝； C： 小鼠腸道Fig. 4 Histochemical staining of fur (A), liver tissue (B) and intestine tissue (C) from aGVHD mice

圖 5 小鼠肝免疫熒光染色 A： 正常小鼠肝NK細(xì)胞； B： 未發(fā)生aGVHD移植鼠肝NK細(xì)胞； C： 發(fā)生aGVHD移植鼠肝NK細(xì)胞(×200)Fig. 5 Immunofuorescence staining of NK cells from normal mice (A), aGVHD-free mice (B) and aGVHD mice (C)

5 組織化學(xué)染色 小鼠aGVHD靶器官皮膚、肝、腸道標(biāo)本HE染色觀察到典型的急性移植物抗宿主病組織病理學(xué)改變。皮膚表皮基底層細(xì)胞有空泡性變，真皮淺層小血管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，小腸腸腺減少，腺上皮細(xì)胞部分壞死，肝有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀嗜酸性壞死。見圖4。

6 免疫熒光染色 aGVHD小鼠的皮膚、腸道NK細(xì)胞免疫熒光染色未發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞(圖片未顯示)。未發(fā)生aGVHD的移植鼠肝組織內(nèi)NK細(xì)胞少量散在分部在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞間，發(fā)生aGVHD移植鼠肝組織內(nèi)匯管區(qū)周圍有NK細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖5。

討 論

NK細(xì)胞殺傷作用無MHC限制性、無需抗原刺激，在造血干細(xì)胞移植中的作用備受關(guān)注[5]。多數(shù)研究認(rèn)為NK細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植后發(fā)揮GVL效應(yīng)的同時(shí)可減輕aGVHD。NK細(xì)胞通過其免疫球蛋白樣受體(KIR)與HLA-Ⅰ類分子錯(cuò)配在移植后殺傷受者樹突狀細(xì)胞阻斷了向供者T細(xì)胞提呈宿主抗原的過程減輕移植物抗宿主病，供者衍生的NK細(xì)胞通過裂解宿主T淋巴細(xì)胞來防止對(duì)移植物的排斥[6]。NK細(xì)胞也參與移植并發(fā)癥的轉(zhuǎn)歸，通過分泌IFN-γ及直接的毒性作用對(duì)控制巨細(xì)胞病毒的感染發(fā)揮積極作用，消化道黏膜中存在特殊的NK細(xì)胞亞群，可促進(jìn)消化道aGVHD損傷后的黏膜再生[7-9]。Small等[10]研究認(rèn)為肺部的NK細(xì)胞可以發(fā)揮抗感染和促進(jìn)上皮細(xì)胞再生，參與移植后肺部感染的抵抗和修復(fù)。

NK細(xì)胞用于小鼠半相合移植預(yù)處理，可以促進(jìn)植入、預(yù)防aGVHD和改善移植后免疫重建[11-12]。陳廣華等[13]人研究小鼠半相合骨髓移植時(shí)同時(shí)植入一定量激活的NK細(xì)胞，可在減輕aGVHD、減少白血病復(fù)發(fā)同時(shí)促進(jìn)免疫重建。Ruggeri等[14]回顧研究報(bào)道臨床半相合骨髓移植的病人接受供者NK細(xì)胞輸注治療可以明顯降低復(fù)發(fā)率、促進(jìn)植入，但并不增加移植物抗宿主病。

急性移植物抗宿主病對(duì)組織器官損傷的免疫病理學(xué)研究目前主要集中在宿主樹突狀細(xì)胞的成熟和激活進(jìn)而啟動(dòng)了供者衍生性T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)[15]。靶器官特異性病理損傷相關(guān)研究較少，F(xiàn)ondi等[16]研究移植物抗宿主病皮損活檢發(fā)現(xiàn)Foxp3+調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增多與輕度GVHD及GVHD的相關(guān)治療反應(yīng)有關(guān)。Gannagé等[17]研究認(rèn)為γ射線及TNF-α調(diào)高組織NKG2D配體的表達(dá)引起了aGVHD組織器官的損傷，并用免疫組化染色觀察到了損傷器官處NKG2D高于正常組織的表達(dá)。Acevedo等[18]研究了aGVHD和cGVHD病人皮膚活檢免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在aGVHD病人表皮和真皮交界處有大量NKp43+ NK細(xì)胞出現(xiàn)，但在cGVHD皮膚活檢組織中NKp43+ NK細(xì)胞僅少量存在，并認(rèn)為NK細(xì)胞參與了aGVHD的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)在aGVHD肝匯管區(qū)有NK細(xì)胞浸潤(rùn)，從免疫病理學(xué)方向說明了NK細(xì)胞參與了肝處移植物抗宿主病的病理反應(yīng)，但NK在其中所發(fā)揮的作用有待探討。NKp46表達(dá)低的小鼠發(fā)生了aGVHD，而NKp46表達(dá)高的小鼠則避免了aGVHD的發(fā)生，NK細(xì)胞在骨髓移植中發(fā)揮減輕aGVHD的作用有利于骨髓移植，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在此過程中NK細(xì)胞的活性明顯增強(qiáng)，為NKp46成為aGVHD診斷、治療效果評(píng)價(jià)的指標(biāo)提供可能。

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Immunopathology of NK cells participating in aGVHD after nonmyeloablative haploidentical bone marrow stem cell transplantation

LEI Ying-ying1,2, DUAN Lian-ning1, LUO Yuan1, GUO Guang-jin1, XU Peng-fei1, LU Cheng-rong1, WANG Zhe1, XIANG Pei-de1
1Clinical Aviation Medical Laboratory, Chinese PLA AIR Force General Hospital, Beijing 100142,China;2Postgraduate Department of Hebei North College, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China

DUAN Lian-ning. Email：Duanlianning@hotmail.com

ObjectiveTo study the immunopathology of NK cells participating in aGVHD after nonmyeloablative haploidentical bone marrow stem cell transplantation.MethodsA mouse aGVHD model was established with C57BL/6 mice as its donor and CB6F1 mice as its receptor. Symptoms and signs of aGVHD were observed, chimerism and NKp46 expression were detected. Distribution of NK cells in aGVHD target organs was detected with immunofuorescence staining.ResultsThe incidence rate of aGVHD was 80%. The chimerism was achieved in 100% receptors 15 days after transplantation. The body weight of mice was reduced and the symptoms of aGVHD mice such as fur and hunched posture developed about 25 days after transplantation. The expression level of NKp46 was lower in aGVHD mice than in aGVHD-free mice. NK cells infltrated from donors into the portal area of receptors.ConclusionNK cells participate in the pathological response of liver graft versus host disease during nonmyeloablative haploidentical bone marrow stem cell transplantation. NKp46 expression is associated with aGVHD, thus providing evidence for the diagnosis of aGVHD.

nonmyeloablative haploidentical bone marrow transplantation; aGVHD; NK cell; NKp46

R 457.7

A

2095-5227(2014)07-0725-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.022

時(shí)間：2014-03-19 08:28

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140319.0828.001.html

2014-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30873014)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(30873014)

雷英英，女，在讀碩士。研究方向：半相合骨髓移植。Email：leiyingying0904@126.com

段連寧，男，博士。Email：Duanlianning@hotmail.com