李 捷，董華進(jìn)

1解放軍總醫(yī)院 胸外科，北京 100853；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850

基礎(chǔ)研究

ETA受體拮抗劑對(duì)急性肺栓塞大鼠的保護(hù)作用

李 捷1，董華進(jìn)2

1解放軍總醫(yī)院 胸外科，北京 100853；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850

目的 探討ETA受體拮抗劑安貝生坦對(duì)急性肺動(dòng)脈栓塞大鼠的保護(hù)作用。方法60只SD大鼠中隨機(jī)取10只作為對(duì)照組；另50只隨機(jī)分為兩組，模型組(25只)給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，安貝生坦組(25只)給予40 mg/kg的安貝生坦灌胃。30 min后，分別自兩組大鼠尾靜脈注射膠原+腎上腺素，制備急性肺栓塞模型。觀察急性肺栓塞大鼠的死亡率。對(duì)未猝死大鼠繼續(xù)給藥，1次/d，連續(xù)1周，用多導(dǎo)生理記錄儀記錄未猝死大鼠及對(duì)照組大鼠的右心室收縮壓、右心指數(shù)、平均肺動(dòng)脈壓的變化，用RT-PCR法測(cè)定右心室肌的心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達(dá)，比較安貝生坦組、模型組和對(duì)照組之間的差異。結(jié)果急性肺栓塞大鼠安貝生坦組的死亡率低于模型組(P＜0.05)；未猝死大鼠繼續(xù)用藥1周后，安貝生坦組右心室收縮壓及平均肺動(dòng)脈壓低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)；安貝生坦組大鼠的右心指數(shù)、心肌ANP mRNA的表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。結(jié)論ETA受體拮抗劑安貝生坦可降低急性肺栓塞大鼠的死亡率，緩解繼發(fā)的肺動(dòng)脈高壓，改善右心室功能。

急性肺栓塞；大鼠；安貝生坦

急性肺動(dòng)脈栓塞(acute pulmonary embolism，PTE)是一種十分兇險(xiǎn)的疾病，其發(fā)病率已躍居心血管疾病發(fā)病率的第3位，PTE發(fā)病后引起廣泛的多系統(tǒng)功能損害，病死率極高，90%的死亡發(fā)生于起病后1 h內(nèi)，由于其致猝死的機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的救治措施[1-3]。近年來(lái)，急性肺栓塞已為我國(guó)常見疾病，每年有29萬(wàn)余患者因急性肺栓塞死亡，國(guó)內(nèi)漏診率和誤診率高達(dá)67%，來(lái)不及治療的肺栓塞患者病死率可達(dá)25% ～ 30%[4]。臨床已經(jīng)證實(shí)，急性肺栓塞發(fā)生時(shí)，肺組織中縮血管因子內(nèi)皮素ET-1含量顯著升高，并在肺動(dòng)脈高壓的形成中起至關(guān)重要的作用[5]。安貝生坦是一種高選擇性ETA拮抗劑，可以阻斷ET與ETA受體的結(jié)合，并對(duì)急性肺栓塞小鼠有保護(hù)作用，能延長(zhǎng)栓塞后小鼠的存活時(shí)間[6]。本研究擬在臨床及對(duì)肺動(dòng)脈栓塞小鼠的研究基礎(chǔ)上，分析ETA受體拮抗劑安貝生坦對(duì)急性肺栓塞大鼠血流動(dòng)力學(xué)的保護(hù)作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 選取60只雄性SD大鼠，3 ～ 4周齡，體質(zhì)量200 ～ 240 g，平均體質(zhì)量(223.6±9.4) g，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0004。藥品：安貝生坦(購(gòu)于Sigma公司)；膠原(美國(guó)Chrono-log公司)；腎上腺素。

2 動(dòng)物分組及模型制備 從60只大鼠中隨機(jī)取10只作為對(duì)照組，剩余50只隨機(jī)分為兩組，一組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃(模型組，25只)，另一組給予40 mg/kg的安貝生坦灌胃(安貝生坦組，25只)。30 min以后，用尾靜脈注射膠原+腎上腺素混合液(膠原1.25 mg/kg+腎上腺素0.05 mg/kg)的方法制備急性肺栓塞模型[7]。以60 min為時(shí)間截點(diǎn)統(tǒng)計(jì)大鼠的死亡率，對(duì)未猝死大鼠繼續(xù)給藥，1次/d，連續(xù)用藥1周后(模型組用0.9%氯化鈉注射液灌胃，安貝生坦組用40 mg/kg的安貝生坦灌胃)，用多導(dǎo)生理記錄儀記錄未猝死大鼠及對(duì)照組大鼠的右心室收縮壓、右心指數(shù)、平均肺動(dòng)脈壓的變化，用RT-PCR法測(cè)定右心室肌的心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達(dá)，比較安貝生坦組、模型組和對(duì)照組之間的差異[8]。

3 行右心導(dǎo)管法測(cè)右心室收縮壓及平均肺動(dòng)脈血壓[9]腹腔注射烏拉坦麻醉大鼠(25%，0.5 ml/100 g)后，分離氣管，行氣管插管，分離頸外靜脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動(dòng)脈夾夾閉，將導(dǎo)管插入并慢慢推進(jìn)，導(dǎo)管經(jīng)右心房、右心室到達(dá)肺動(dòng)脈，連接壓力換能器。用MedLab生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄右心室壓力、肺動(dòng)脈血壓的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，過(guò)量麻醉大鼠致安樂(lè)死。右心室壓力及肺動(dòng)脈血壓的抑制率由以下公式得出：

抑制率(%)=100×(模型組壓力－安貝生坦組壓力)/(模型組壓力－對(duì)照組壓力)。

4 右心指數(shù)測(cè)定 測(cè)定壓力結(jié)束后，取出大鼠心臟，分離右心室自由壁、左心室及室間隔，用濾紙吸干，萬(wàn)分之一級(jí)分析天平稱重。右心指數(shù)=右心室自由壁(RV)重/左心室及室間隔(LV+S)重，確定大鼠右心肌肥厚程度。

5 RT-PCR法檢測(cè)心肌組織ANP mRNA的表達(dá)

取心肌組織加入適量Trizol試劑勻漿、裂解，取1 ml裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收總RNA，貯存于-70℃待用。以1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)A260/A280鑒定RNA純度和濃度。取約1 μg總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 60 min，99℃ 2 min，4℃保存。ANP的引物序列(5'-3')為GGCTCCTTCTCCATCACCAATGTT ATCTTCGGTACCG，內(nèi)參GAPDH的引物序列(5'-3')為CAAAGTTGTCATGGATGACCATGGAGAAGGC TGGG[10]。上述引物由北京奧科生物有限公司合成，滅菌水溶解并配制成100 μmol/L的上下游引物混合液，使用濃度為20 μmol/L。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，終末延伸72℃ 5 min，4℃終止，20個(gè)循環(huán)。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μl產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用表示，組間比較用單因素方差分析結(jié)合Student-Newman-Keuls t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺動(dòng)脈栓塞模型的制備 用尾靜脈注射膠原+腎上腺素混合液(膠原1.25 mg/kg+腎上腺素0.05 mg/kg)的方法制備肺動(dòng)脈栓塞模型，給藥10 ～ 15 min后，大鼠便出現(xiàn)明顯顫動(dòng)、呼吸加快、發(fā)紺等癥狀，表明模型制備成功[2]。

2 模型組與安貝生坦組大鼠死亡率比較 模型組大鼠的死亡率為76%(19/25)，安貝生坦組大鼠的死亡率為52%(13/25)，安貝生坦組大鼠的死亡率低于模型組(P＜0.05)，表明安貝生坦能夠降低急性肺栓塞大鼠的死亡率。

3 安貝生坦對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 對(duì)未猝死大鼠繼續(xù)給藥，1次/d，連續(xù)用藥1周后，模型組大鼠右心室收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)升高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，說(shuō)明急性肺栓塞引起大鼠繼發(fā)性肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)改變；安貝生坦組右心室收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和右心指數(shù)均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然均高于對(duì)照組(P＜0.05)，表明安貝生坦在一定程度上改善急性肺栓塞大鼠繼發(fā)性肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)變化。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 安貝生坦對(duì)未猝死急性肺栓塞大鼠肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)的影響Tab. 1 Effect of ambrisentan on pulmonary circulation hemodynamics in APC rats (-x±s)

4 安貝生坦對(duì)大鼠右心室心肌組織ANP mRNA表達(dá)量的影響 對(duì)未猝死大鼠繼續(xù)給藥，1次/d，連續(xù)用藥1周后，模型組大鼠右心室心肌組織ANP的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，安貝生坦組右心室心肌組織ANP mRNA的表達(dá)顯著降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示ETA受體拮抗劑安貝生坦可改善急性肺栓塞引起的心肌細(xì)胞肥大。見圖1。

圖 1 安貝生坦對(duì)未猝死急性肺栓塞大鼠右心室心肌組織ANP mRNA表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of ambrisentan on ANP mRNA expression in myocardium of survived APC rats (bP＜0.05, vs model group)

討 論

研究報(bào)道，血管相關(guān)性因子在急性肺動(dòng)脈栓塞動(dòng)物的病理改變中起重要作用[11]。內(nèi)皮素(ET-1)是重要的血管收縮因子，具有強(qiáng)烈的收縮血管的作用，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)縮血管因子，ET-1濃度的增高可引起肺血管和支氣管痙攣并增加毛細(xì)血管通透性，它能激活位于肺血管平滑肌的ET受體，增高血管張力，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并促使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流等[5]。健康人血液中ET-1的含量為0.6% ～ 0.7%，文獻(xiàn)報(bào)道在急性肺動(dòng)脈栓塞后24 h，血漿ET-1的含量升高很快，甚至在栓塞后2周含量仍然很高，其拮抗劑能有效地降低栓塞引起的肺動(dòng)脈高壓[12]。我們之前的研究提示，安貝生坦能延長(zhǎng)急性肺動(dòng)脈栓塞小鼠的存活時(shí)間，減輕肺水腫，對(duì)肺栓塞小鼠起到一定的保護(hù)作用[6]。在對(duì)肺動(dòng)脈栓塞小鼠的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討ETA受體拮抗劑安貝生坦對(duì)急性肺栓塞大鼠血流動(dòng)力學(xué)的保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1)肺動(dòng)脈栓塞60 min時(shí)，安貝生坦組大鼠的死亡率(52%)明顯低于模型組(76%)；2)對(duì)未猝死肺栓塞大鼠用安貝生坦繼續(xù)進(jìn)行干預(yù)1周后，其血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生了變化。對(duì)照組右心室收縮壓為(26.1±4.6) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，而模型組高達(dá)(58.1±9.3) mmHg，是前者的2倍，安貝生坦(40 mg/kg)組為(46.3±8.6) mmHg，抑制率為36.9%；3)對(duì)照組平均肺動(dòng)脈壓為(14.8±0.9) mmHg，模型組升高至(25.3±2.1) mmHg，安貝生坦(40 mg/kg)組為(21.9±2.7) mmHg，抑制率為32.3%；4)對(duì)照組的右心指數(shù)為0.263±0.026；1周后，模型組大鼠右心指數(shù)達(dá)到0.425±0.028，安貝生坦(40 mg/kg)組右心指數(shù)降至0.386±0.037；5)模型組心肌組織ANP的表達(dá)較對(duì)照組升高，安貝生坦組心肌組織ANP mRNA的表達(dá)較模型組降低，ANP的表達(dá)量增加又是心肌細(xì)胞肥大的標(biāo)志性變化。分析以上結(jié)果，提示ETA受體拮抗劑安貝生坦可改善急性肺栓塞引起的右心室收縮壓、肺動(dòng)脈高壓等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，有減輕右心室心肌損傷、改善右心室肥厚的作用。以上這些血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化是臨床預(yù)后的理論基礎(chǔ)，是探討PTE血流動(dòng)力學(xué)變化的簡(jiǎn)便、實(shí)用、直觀的方法[13]。國(guó)際上，右心室功能不全已列為急性肺栓塞風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)的主要指標(biāo)來(lái)預(yù)估肺栓塞患者的早期死亡率[3]。右心室肥厚如不及時(shí)干預(yù)，可導(dǎo)致心力衰竭[14]。

綜上所述，安貝生坦作為一種高效的ETA受體拮抗劑，能改善急性肺栓塞模型的血流動(dòng)力學(xué)，減輕心室肌細(xì)胞的損傷，藥物作用值得肯定。關(guān)于ETA受體拮抗劑安貝生坦在抑制肺栓塞發(fā)病機(jī)制中的其他作用，尚需進(jìn)一步探討。

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Role of ETA-receptor antagonist in protecting rats against acute pulmonary embolism

LI Jie1, DONG Hua-jin2
1Department of Thoracic Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China
The frst author: LI Jie. Email：ljpla301@163.com

ObjectiveTo study the role of ETA-receptor antagonist, ambrisentan in protecting rats against acute pulmonary embolism (APE).MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=25), ambrisentan treatment group (n=25). Thirty minutes after the rats in model group received intragastric injection of 0.9% normal saline and those in ambrisentan treatment group received intragastric injection of ambrisentan (40 mg/kg), an APE model was established by injecting collagen + epinephrine via the tail vein to observe the mortality of rats. The right ventricular systolic pressure, right ventricular index and mean pulmonary artery pressure were recorded using a multichannel physiology recorder, the expression of atrial natriuretic peptide (ANP) mRNA in right ventricular muscle was detected by RT-PCR, and the difference in 3 groups was compared after the survived rats were given drugs, once a day for 1 week.ResultsThe mortality was obviously lower in ambrisentan treatment group than in model group (P＜0.05). The right ventricular systolic pressure and mean pulmonary artery pressure were signifcantly lower in the survived rats of ambrisentan treatment group than in those of model group 1 week after drug treatment and signifcantly higher than in control group (P＜0.05). Ambrisentan inhibited the expression of ANP mRNA in myocardium (P＜0.05) and the right ventricular index was lower in Ambrisentan group than in model group (P＜0.05).ConclusionAmbrisentan, an ETA-receptor antagonist, can decrease the mortality of APC rats, relieve their secondary pulmonary arterial hypertension and improve their right ventricular function.

acute pulmonary embolism; rats; ambrisentan

R 563.5

A

2095-5227(2014)07-0718-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.020

時(shí)間：2014-03-20 08:37

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140320.0837.001.html

2013-11-08

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)(2006AA020601)

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(2006AA020601)

李捷，男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：肺動(dòng)脈栓塞、肺部腫瘤的診斷及外科治療。Email：lipla301@163.com