李娟莉 陸奕宇 蘇式兵

心肌缺血常見(jiàn)于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，是由于心臟冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害。心肌缺血嚴(yán)重者可導(dǎo)致缺血局部的心肌梗死，甚至引起猝死。目前，臨床上尚缺乏能夠有效改善心肌缺血、預(yù)防心肌梗死，且安全的藥物。中藥復(fù)方碧血膠囊具有改善實(shí)驗(yàn)大鼠心功能和血流動(dòng)力學(xué)［1］和血液流變性［2］以及降低血脂的作用［3］。本研究采用大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型，通過(guò)測(cè)定用藥前后大鼠模型心電圖、心梗面積以及血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的變化，進(jìn)一步觀察了碧血膠囊對(duì)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈造成心肌梗死的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用7 周齡的健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，2010年5月購(gòu)入(動(dòng)物許可號(hào)SCXK2007-0005)。

1.2 分組及給藥

將SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只，分別為:假手術(shù)組、急性心肌梗塞模型(AMI)組、碧血膠囊(原料藥的重量配比為:三七總皂苷5 份，絞股藍(lán)總皂苷5 份，竹葉提取物4 份，水蛭細(xì)粉20 份)高劑量組(968 mg/kg)和低劑量組(484 mg/kg)，通心絡(luò)膠囊組(500 mg/kg)，地爾硫卓靜脈滴注組［4.5 mg/(200 g·d)，30～40 分鐘內(nèi)滴完］。由于在手術(shù)中出現(xiàn)結(jié)扎所致的出血、心律失常等，導(dǎo)致大鼠的死亡，各組大鼠最終的統(tǒng)計(jì)分析動(dòng)物數(shù)均為8 只。

1.3 實(shí)驗(yàn)性AMI 大鼠模型的制備

按照文獻(xiàn)進(jìn)行模型制備［4］。實(shí)驗(yàn)大鼠各給藥組按照上述劑量每天1 次，灌胃1 周，各組最后統(tǒng)計(jì)分析的動(dòng)物數(shù)均為8 只。在各灌胃組末次給藥后2小時(shí)后手術(shù)，地爾硫卓組在急性手術(shù)前10 分鐘尾靜脈注入。除假手術(shù)組開(kāi)胸過(guò)線(xiàn)但不結(jié)扎外，其余動(dòng)物行開(kāi)胸手術(shù)建立AMI 模型。具體方法是以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，大鼠背位固定，連接記錄心電圖的記錄電極，頸部皮膚切開(kāi)氣管，連接C201 型動(dòng)物呼吸機(jī)。同時(shí)進(jìn)行左心室插管，待插管穩(wěn)定30 分后，剃光左側(cè)胸部毛發(fā)，在胸部第二、三肋間偏左4～5 mm 處施開(kāi)胸術(shù)，暴露心臟，剪開(kāi)心包，在左心耳根部下方2 mm 處進(jìn)針，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，肉眼觀察結(jié)扎線(xiàn)以下心肌立刻出現(xiàn)黑紫，即造成急性心肌缺血模型［5］。迅速關(guān)閉胸腔縫合，各組動(dòng)物均于結(jié)扎即刻或幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)ST 抬高或降低，有的可伴有T波抬高或降低，則結(jié)扎手術(shù)成功。若ST 段或T 波不抬高或不降低者棄之。

1.4 試劑和儀器

通心絡(luò)膠囊膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字219980015，石家莊以嶺藥業(yè));地爾硫卓(田邊制藥株氏會(huì)社日本大阪工廠生產(chǎn)，天津田邊公司分裝，分裝批號(hào)0902002);碧血膠囊(每粒膠囊0.43 g，由上海埃克生物制品有限公司提供，批號(hào)080228);氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F10091214);MDA、SOD、LDH 和CK 試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。RM 6240 型生物信號(hào)處理采集處理系統(tǒng)和C201 型動(dòng)物呼吸機(jī):四川成都儀器廠;ECG-6511 心電圖機(jī):上海醫(yī)療電子儀器公司;Synergy2酶標(biāo)儀:美國(guó)伯騰儀器有限公司(BioTek)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 心電圖觀察 連接RM6240 型生物信號(hào)處理采集處理系統(tǒng)，記錄心電圖(ECG)，術(shù)畢，在5、10、30、60 分鐘分別進(jìn)行心電圖記錄，觀察T 波的變化。

1.5.2 組織病理學(xué)觀察 取下心臟稱(chēng)重，沿冠狀溝剪去大血管根部和心房，稱(chēng)左心室重，并將其均勻地橫斷切成5 片，置于N-BT 染液中，在37℃恒溫水浴箱中染色15 分鐘。測(cè)量每片心肌雙側(cè)梗死區(qū)(NBT 非染色區(qū))與非梗塞區(qū)(NBT 染色區(qū))，待梗死心肌界線(xiàn)清楚時(shí)立即取出，切取梗死心肌并稱(chēng)重。以梗死心肌與心室濕重或心臟重量的百分比做為心肌梗死面積(myocardial infarct size，MIS)［6］。

1.5.3 血清CK、LDH、SOD、MDA 含量的檢測(cè) 從大鼠腹主動(dòng)脈采血3 ml 并分離血清后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明在BIOTEK 酶標(biāo)儀上檢測(cè)血清中LDH、CK、SOD、MDA 的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 軟件，所有結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，6 組資料間的上述指標(biāo)(T波、CK、SOD、MDA 及心梗面積)的組間比較，各組間整體分析用單因素ANOVA 方差分析，兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)方法;LDH 應(yīng)用非參檢驗(yàn)Kruskal-Wallis方法分析;T 波的檢驗(yàn)，用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析方法，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 碧血膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血后T 波的影響

大鼠急性心肌缺血后，與缺血前相比，各組T波均顯著升高，并且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)有所恢復(fù);經(jīng)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，與AMI 組相比，假手術(shù)組，碧血膠囊高劑量組、碧血膠囊低劑量組、通心絡(luò)組、地爾硫卓組，各組在缺血的不同時(shí)間后的T波升高，都顯著低于AMI 組(P＜0.01)。這表明各用藥組在不同的時(shí)間點(diǎn)均能降低急性缺血后所造成的T 波的升高，見(jiàn)表1。圖1分別顯示了碧血膠囊用藥組與AMI 組間T 波變化的區(qū)別。

2.2 碧血膠囊對(duì)大鼠血清LDH、CK、SOD 和MDA的影響

如表2所示，大鼠急性心肌缺血后，與缺血前相比，各組LDH、CK 均升高。各用藥組CK 均降低，運(yùn)用單因素方差分析，F(xiàn)=1.62，P=0.047，這表明各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與AMI 組相比，運(yùn)用LSD 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示除碧血膠囊低劑量組(P=0.17 外)，各組均有顯著性差異(高劑量組P=0.018，通心絡(luò)組P=0.007，地爾硫卓組P=0.005)。各用藥組血清LDH 與模型組相比，有降低趨勢(shì)，運(yùn)用非參檢驗(yàn)Kruskal-Wallis 方法，P=0.07，這表明各組間均無(wú)顯著性差異。與模型組相比，其中各用藥組MDA 降低，運(yùn)用單因素方差分析，F(xiàn)=1.07，P=0.03，這表明各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與AMI 組相比，運(yùn)用LSD檢驗(yàn)，結(jié)果顯示除碧血膠囊低劑量組(P=0.09 外)，各組均有顯著性差異(高劑量組P=0.01，通心絡(luò)組P=0.005，地爾硫卓組P=0.004)。各用藥組血清SOD 與模型組相比，有增加趨勢(shì)。運(yùn)用單因素方差分析，F(xiàn)=1.2，P=0.8，這表明各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 碧血膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血T 波的影響(±s，mV，n=8)

表1 碧血膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血T 波的影響(±s，mV，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 缺血前 缺血后0 min 缺血后10 min 缺血后30 min 缺血后45 min 缺血后60 min假手術(shù)組 133.4±15.2 141.8±15.1 142.7±17.3b 145.8±17.5b 144.5±19.2b 147.3±17.4 b AMI 組 120.7±4.0 260.8±43.0 309.6±19.7 322.9±20.0 350.7±30.9 345.4±30.1碧血膠囊高劑量組 132.0±10.7 172.5±16.9b 149.9±20.5b 154.1±21.2b 179.7±15.4b 171.0±12.6b碧血膠囊低劑量組 122.9±24.6 159.0±19.0b 167.7±30.0b 194.1±49.6b 188.1±45.7b 181.7±44.8b通心絡(luò)組 98.1±11.1 101.7±12.5b 130.2±15.2b 124.8±18.3b 141.4±18.6b 134.3±8.9b地爾硫卓組 127.7±17.9 160.2±30.1b 161.5±40.6b 163.4±33.7b 175.2±32.3b 159.4±27.5 b

圖1 AMI 組、碧血膠囊組結(jié)扎后T 波變化

表2 碧血膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血后血清LDH、CK、SOD 和MDA 的影響(±s，n=8)

表2 碧血膠囊對(duì)大鼠急性心肌缺血后血清LDH、CK、SOD 和MDA 的影響(±s，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 LDH(U/L)CK(μ/ML)SOD(μ/ml)MDA(nmol/ml)797±108 0.7±0.12 151.6±22.7 0.86±0.19 AMI 組 1469±154 1.2±0.10 100.5±13.6 1.91±0.31假手術(shù)組碧血膠囊高劑量組 1006±78 0.7±0.12a 137.2±36.7 1.07±0.26a碧血膠囊低劑量組 971±95 0.9±0.08 111.2±33.8 1.35±0.19通心絡(luò)組 944±157 0.6±0.14b 148.6±24.8 0.90±0.23b地爾硫卓組 916±130 0.6±0.12b 142.1±22.7 0.80±0.11 b

2.3 碧血膠囊對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

如表3所示，心梗面積運(yùn)用單因素方差分析，F(xiàn)=1.32，P=0.000，這表明各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與AMI 組比較，碧血膠囊高劑量組(P=0.006)、通心絡(luò)組(P=0.000)、地爾硫卓(P=0.002)組均能顯著減少缺血所致的心肌梗死面積，碧血膠囊低劑量組(P=0.096)也能降低心肌梗死的面積，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。圖2顯示了大鼠AMI 模型及各用藥組的心梗面積(NBT 染色)。

表3 碧血膠囊對(duì)大鼠心肌梗塞面積的影響(±s，n=8)

表3 碧血膠囊對(duì)大鼠心肌梗塞面積的影響(±s，n=8)

注:與AMI 組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 心室重量(g) 梗死心肌重量(g)假手術(shù)組——AMI 組 0.73±0.02 0.11±0.01b碧血膠囊高劑量組 0.67±0.01 0.07±0.01a碧血膠囊低劑量組 0.70±0.01 0.10±0.01通心絡(luò)組 0.66±0.02 0.02±0.00b地爾硫卓組 0.68±0.01 0.06±0.01 b

圖2 各組大鼠AMI 后心梗面積的變化

3 討論

結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支可引起急性心肌缺血及梗死。此法所致的急性心肌損后血流動(dòng)力學(xué)和心肌代謝的改變類(lèi)似于人類(lèi)嚴(yán)重急性心肌缺血或心肌梗死，且梗死發(fā)生快、缺血的范圍固定，故大鼠冠脈結(jié)扎法常用于抗心肌缺血藥物的研究［7-8］。本研究表明，與假手術(shù)組相比，急性心肌梗死組缺血后所致心電圖T 波高抬(超過(guò)0.1 mV)，表明急性心肌缺血、梗死的模型成功建立。

本研究采用N-BT 組織化學(xué)染色法直接測(cè)定心肌梗死范圍，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)T 波的改變和測(cè)定血清酶學(xué)指標(biāo)間接反映心肌梗死范圍及程度，結(jié)合抗脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，綜合考察碧血膠囊抗心肌缺血作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，碧血膠囊能降低T 波抬高程度，明顯抑制血清CK、LDH 水平升高，這表明碧血膠囊對(duì)冠脈結(jié)扎致大鼠急性心肌缺血具有良好的保護(hù)作用。

急性心肌缺血后，血清CK、LDH 活性明顯升高，代表細(xì)胞損傷的開(kāi)始，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織壞死，所以酶的漏出被認(rèn)為是細(xì)胞完全壞死前的改變［9-10］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，碧血膠囊能顯著降低CK、LDH活性，與模型組相比，CK 活性的降低有顯著性差異。(LDH 有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異)，與縮小心肌梗死面積相吻合。冠脈結(jié)扎致心肌缺血缺氧，活性氧簇產(chǎn)生增多，而活性氧簇觸發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)又加重心肌細(xì)胞損傷［11］。通過(guò)測(cè)定內(nèi)源性抗氧化酶如SOD 活性和過(guò)氧化脂質(zhì)MDA 的變化，間接評(píng)價(jià)活性氧簇對(duì)機(jī)體造成的損傷程度。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，碧血膠囊能明顯抑制血清MDA 水平升高，與模型組相比，有顯著性差異，并能增加血清SOD 水平的趨勢(shì)。本研究表明碧血膠囊抗心肌缺血作用機(jī)制可能是通過(guò)改善心電圖，提高心肌對(duì)缺血損傷的耐受性，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)內(nèi)源性抗氧化酶活性而發(fā)揮作用。

碧血膠囊心肌缺血作用機(jī)制可能是通過(guò)改善心外膜抗心肌缺血的機(jī)制可能與其主要成分有關(guān)。碧血膠囊主要是由三七、水蛭、絞股藍(lán)組成。它具有活血化瘀，降低血液黏滯度，改善心肌缺血缺氧，降低血脂等作用［1-3］。現(xiàn)代藥理研究表明，三七的主要活性成分為三七總皂苷具有明顯的降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、降血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化、抗心律失常等作用［10-11］。徐靈建等［12］報(bào)道了復(fù)方水蛭精膠囊能降低心肌缺血再灌后脂質(zhì)過(guò)氧化物，升高血清SOD 濃度，降低cAMP 值，降低全血黏度、血漿黏度、降低心肌梗死范圍。熊維生等［13］報(bào)道絞股藍(lán)的主要成份絞股藍(lán)皂苷能縮小家兔心肌梗死范圍，抑制心梗后游離脂肪酸升高，降低梗死心肌MDA 含量，并能抗缺血及再灌注損傷作用，其機(jī)理可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

以上結(jié)果提示，碧血膠囊抗心肌缺血作用機(jī)制可能通過(guò)三七、絞股藍(lán)、水蛭等成分的共同作用，改善心電圖，提高心肌供血，對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)內(nèi)源性抗氧化酶活性，從而降低MIS，進(jìn)而起到保護(hù)缺血心肌的作用，本研究為碧血膠囊防治冠心病心肌缺血，減少心肌梗死的發(fā)生率提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其是否亦通過(guò)影響鈣超載以及其它調(diào)節(jié)發(fā)揮改善AMI 后心功能的藥理作用機(jī)制尚待進(jìn)一步較深入研究。

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