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        中藥白疕合劑對銀屑病樣動物模型影響的實驗研究

        2014-04-21 07:13:32盧益萍李忻紅馬賢德董靈玉
        環(huán)球中醫(yī)藥 2014年4期
        關(guān)鍵詞:消銀豚鼠合劑

        盧益萍 李忻紅 馬賢德 董靈玉

        銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚?。?]?,F(xiàn)代研究證實,炎癥細胞浸潤、微血管改變及表皮角質(zhì)形成細胞的過度增殖為銀屑病病理改變的三個特征[2]。從表皮細胞增殖及微血管角度進行銀屑病機制研究是目前研究熱點,本研究通過建立銀屑病樣實驗動物模型從血清中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)含量、cAMP/cGMP 比值及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growh factor,VEGF)水平方面,研究中藥白疕合劑治療銀屑病的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 藥品及主要試劑

        白疕合劑(院內(nèi)自制中藥濃縮煎劑,制劑號:Z05010105,主要組成:丹參15 g、地黃20 g、赤芍20 g、山豆根20 g、板藍根20 g、金銀花30 g、白茅根20 g、白花蛇舌草30 g、全蝎10 g、黃柏20 g);消銀顆粒(陜西康惠制藥股份有限公司,批號:Z20000019,組成:地黃、牡丹皮、當歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、防風、大青葉、紅花);cAMP、cGMP 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(上海越研生物科技有限公司提供,批號201210);VEGF ELISA檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司提供)。5%鹽酸普萘洛爾乳劑(純鹽酸普萘洛爾原料藥由天津力生制藥股份有限公司提供,批號H12020151,乳劑基質(zhì)由沈陽市日用化工廠提供,取鹽酸普萘洛爾原料藥加入基質(zhì)中配制)。

        1.2 動物

        健康豚鼠60 只,體重(300±30)g,雄雌各半,購自大連醫(yī)科大學,動物許可證號:SCXK(遼)2008-0002,分籠飼養(yǎng)于實驗動物中心實驗室。

        1.3 儀器

        電子天平(上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn))、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、低溫高速離心機(德國HERAEUS 生產(chǎn))、酶標儀(奧地利Anthos Labtec Instruments 生產(chǎn))。

        1.4 實驗方法

        1.4.1 實驗分組 健康豚鼠,采用隨機數(shù)字表法隨機分為6 組:(1)正常組;(2)模型組、(3)白疕合劑低劑量組;(4)白疕合劑中劑量組;(5)白疕合劑高劑量組;(6)消銀顆粒組。

        1.4.2 動物造模 先脫去豚鼠背毛,約4 cm×4 cm大小,3 天后開始實驗。對照組脫毛處僅外涂乳劑基質(zhì),其余各組均外涂5%鹽酸普萘洛爾乳劑,范圍約3 cm×3 cm(1 cm×1 cm 用藥0.3 g),2 次/天,連續(xù)3周。造模成功,造成豚鼠背部的銀屑病樣動物模型。

        1.4.3 用藥 灌胃量4 ml/只,白疕合劑用藥量(成人每日100 ml/70 kg),按照人與豚鼠體表面積比例進行換算,計算得出豚鼠給藥劑量為每天7.74 ml/kg,以此濃度設(shè)定為中劑量組,低劑量組給藥劑量為3.87 ml/kg,高劑量組給藥劑量為15.48 ml/kg。陽性對照組按人鼠等效劑量灌胃,消銀顆粒組為0.81 g/kg。正常組與模型組豚鼠每日以等量生理鹽水灌胃。

        1.4.4 ELISA 法檢測對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響 上述豚鼠未處死前取血,離心2000 r/min,取血清,采用酶聯(lián)免疫試劑盒,按試劑盒說明書要求進行檢測光密度,根據(jù)標準曲線計算結(jié)果,根據(jù)結(jié)果計算cAMP/cGMP 比值。

        1.4.5 ELISA 法檢測對血清血管內(nèi)皮生長因子水平的影響 上述豚鼠未處死前取血,離心2000 r/min,取血清,采用酶聯(lián)免疫試劑盒,按試劑盒說明書要求進行檢測光密度,根據(jù)標準曲線計算結(jié)果。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        所獲數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 版本軟件進行分析。計量資料實驗數(shù)據(jù)以(±s)表示,并進行單因素方差分析。方差齊性檢驗采用Levene 法。各樣本間比較應(yīng)用SNK 檢驗,實驗組與對照組比較用Dunnett-t 檢驗,各組兩兩比較用LSD 檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響

        銀屑病豚鼠模型血清cAMP 含量均顯著降低,cGMP 含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,白疕合劑各劑量組和消銀顆粒組cAMP 含量均顯著升高(P<0.01),cGMP 含量均降低(P<0.01),cAMP/cGMP 比值均升高(P<0.01);消銀顆粒組與白疕合劑高劑量組cGMP 含量及cAMP 含量比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。消銀顆粒組與白疕合劑各劑量組cAMP/cGMP 比值比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示白疕合劑能夠增高銀屑病豚鼠模型血清中cAMP 的含量,降低銀屑病模型豚鼠血清中cGMP 的含量,白疕合劑高劑量效果優(yōu)于消銀顆粒。白疕合劑能夠升高銀屑病模型豚鼠血清中cAMP/cGMP比值,且隨濃度的增高作用增強,對cAMP/cGMP比值的調(diào)節(jié),白疕合劑與消銀顆粒無差別,見表1、圖1。

        表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s,n=8)

        表1 對血清cAMP、cGMP 的含量及比值的影響(±s,n=8)

        注:與空白對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01;與消銀顆粒組比較,cP<0.05;與消銀顆粒組比較,dP>0.05

        組別 cAMP(pmol/ml)cGMP(pmol/ml)cAMP/cGMP空白對照組 25.79±1.96b 1.91±0.09b 13.54±1.49 b模型組 5.18±0.35a 4.15±0.12a 1.25±0.09a白疕高劑量組 10.00±0.46abc 3.14±0.10abc 3.18±0.12abd白疕中劑量組 9.57±0.63ab 3.26±0.15ab 2.94±0.25abd白疕低劑量組 8.83±0.34ab 3.66±0.13ab 2.42±0.08abd消銀顆粒組 9.11±0.26ab 3.27±0.14ab 2.79±0.16 ab

        圖1 各組血清cAMP/cGMP 比值的比較

        2.2 對血清VEGF 水平的影響

        銀屑病豚鼠模型血清VEGF 顯著高于正常組,造模成功。經(jīng)治療,中藥白疕合劑治療各劑量組與消銀顆粒組血清VEGF 均低于模型組(P<0.01),高劑量組與空白對照組無顯著性差異(P>0.05),低劑量組與消銀顆粒組無顯著性差異(P>0.05),但仍高于正常對照組(P<0.05),見表2。

        表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

        表2 對血清VEGF 水平的影響(±s)

        注:與正常對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01

        組別 n VEGF(pg/ml)與消銀顆粒組比較空白對照組 8 68.21±3.71b<0.01模型組 8 111.29±6.16a<0.01白疕高劑量組 8 72.14±2.98b<0.01白疕中劑量組 8 75.99±2.98ab<0.05白疕低劑量組 8 82.31±4.60ab>0.05消銀顆粒組 8 81.24±6.10 ab

        3 討論

        中藥白疕合劑為遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院積數(shù)十年治療銀屑病的臨床經(jīng)驗而研制成的院內(nèi)制劑,取得了確切滿意的療效,尤以進展期效果最為顯著。課題組對該中藥多角度進行了動物模型研究,以進一步明確該中藥治療銀屑病的作用機制。

        現(xiàn)在研究認為,銀屑病表皮增生與cGMP/cAMP的比率增高有關(guān)[3]。環(huán)核苷酸cAMP 和cGMP 的調(diào)節(jié)對表皮細胞的生長和分化有重要意義。cAMP 通過激活磷酸化酶加速糖原代謝,從而抑制表皮有絲分裂,減慢轉(zhuǎn)換率,并抑制細胞周期的進程,從而達到抑制細胞增殖的作用。cGMP 在表皮細胞的增殖、分化中也起一定的作用。它能促進表皮的增殖。cGMP 可以調(diào)節(jié)cAMP 的濃度及其信號通路,和cAMP 是人體對立的兩種調(diào)節(jié)系統(tǒng),在細胞增殖發(fā)動時,細胞內(nèi)的cAMP 含量降低,cGMP含量增高。cAMP 抑制細胞生長繁殖,cGMP 則增強細胞繁殖?,F(xiàn)在認為,銀屑病表皮的增生不是簡單的由于cAMP 減少和cGMP 增高,更重要的是cGMP/cAMP 的比率增高所致。

        VEGF 又稱血管通透因子(vascular permeability factor,VPF),屬于生長因子中的血小板衍生的生長因子家族之一。在眾多血管生成因子中,VEGF 是唯一能特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的因子,是目前已知最強的促血管生成因子[4]。VEGF 的主要作用是促進血管內(nèi)皮細胞增生,提高血管的通透性。銀屑病的病理損害中經(jīng)常有VEGF 及其受體表達的增高,這可能是銀屑病發(fā)病中一些炎癥反應(yīng)及真皮乳頭血管增生的分子基礎(chǔ)[5]。銀屑病患者皮損VEGF 增多,抑制患者VEGF 的生成可以用來治療該?。?]。

        本研究結(jié)果顯示,中藥白疕合劑可能通過提高血清中cAMP 含量、降低cGMP 含量、調(diào)節(jié)cAMP/cGMP 比值抑制銀屑病表皮細胞增殖。通過降低血清VEGF 水平,從作用于微血管角度調(diào)節(jié)銀屑病發(fā)病的部分炎癥和免疫過程,取得療效。下一步課題組會繼續(xù)深入探討該藥對銀屑病的其它免疫學機制的相關(guān)影響。

        [1]鄭敏.銀屑病發(fā)病機制研究中若干問題的思考[J].中華皮膚科雜志,2006,39(3):121-123.

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        [4]Dvorak AM,F(xiàn)eng D.The vesiculo-vaeuolar orsanelle(VVO).A new endothelial cell permeability organelle[J].J Histoehem Cytoohem,200l,49(4):419-432.

        [5]王剛,張開明.銀屑病[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:71.

        [6]Creamer D,Allen M,Jaggar R,et al.Mediation of systemic vascular hyperpermeability in severe psoriasis by circulating vascular en dothelial growth factor[J].Arch Dermatol,2002,138 (6):791-796.

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