周 昆，朱桃桃，張 玥，代 志

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心，深圳 518110）

壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)大鼠肝微粒體P450的影響*

周 昆1，朱桃桃1，張 玥1，代 志2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心，深圳 518110）

[目的]考察壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450的影響。[方法]壯骨關(guān)節(jié)丸及其兩個(gè)新工藝按含生藥2.1 g/kg連續(xù)給大鼠灌胃7 d，末次藥后24 h斷頭處死大鼠并取肝臟，用鈣沉降法制備肝微粒體。在體外用含氨苯砜、非那西丁、奧美拉唑、氯唑沙宗的cocktail探針代謝來考察肝微粒體CYP3A、CYP1A2、CYP2C19、CYP2E1的活性。[結(jié)果]cocktail探針在體外肝微粒體系統(tǒng)中代謝1 h后，包括壯骨關(guān)節(jié)丸及其兩個(gè)新工藝的給藥組剩余氯唑沙宗濃度顯著高于對(duì)照組，而奧美拉唑、非那西丁、氨苯砜濃度與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)論]壯骨關(guān)節(jié)丸可以抑制大鼠肝臟CYP2E1活性，但對(duì)CYP1A2、CYP3A及CYP2C19無顯著影響。

壯骨關(guān)節(jié)丸；細(xì)胞色素P450；CYP1A2；CYP2E1；CYP2C19；CYP3A

壯骨關(guān)節(jié)丸主要用于治療骨性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損，自20世紀(jì)90年代上市以來其療效得到了證實(shí)[1-3]，被《中國(guó)藥典》收載，但和大部分復(fù)方中成藥一樣，限于時(shí)代技術(shù)和觀念的影響，缺乏足夠的現(xiàn)代藥理毒理學(xué)研究支持。由于極少數(shù)患者在長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)使用壯骨關(guān)節(jié)丸后出現(xiàn)肝功能異常等肝毒性表現(xiàn)，筆者進(jìn)行了有關(guān)壯骨關(guān)節(jié)丸肝毒性藥材的篩選研究[4]，并針對(duì)毒性藥材進(jìn)行了減毒研究，最后根據(jù)壯骨關(guān)節(jié)丸制備工藝不同分為壯骨1號(hào)方和壯骨2號(hào)方。研究細(xì)胞色素P450的活性對(duì)闡述藥物的體內(nèi)代謝以及聯(lián)合用藥的安全性等具有重要意義，為此本研究用氨苯砜、非那西丁、奧美拉唑、氯唑沙宗組合cocktail探針在體外肝微粒體中的代謝的方法，考察了壯骨關(guān)節(jié)丸及其兩個(gè)新工藝壯骨1號(hào)方和壯骨2號(hào)方對(duì)P450活性的影響，以幫助了解壯骨關(guān)節(jié)丸的毒性機(jī)制和用藥安全性。

1 材料與方法

1.1 受試藥 壯骨關(guān)節(jié)丸（批號(hào)1006103）、壯骨1號(hào)方（批號(hào)1006102）、壯骨2號(hào)方（批號(hào)1006101），均由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供。

1.2 試劑與儀器 氨苯砜（Fluka）；非那西丁，氯唑沙宗（Alfa Aesar）；奧美拉唑（中檢所）NADPH，Tris（Sigma）；甲醇，乙腈（國(guó)產(chǎn)色譜純）；CaCl2，KCl，K2HPO4，H3PO4，HCl等（國(guó)產(chǎn)分析純）。

AX205分析天平（梅特勒托利多），L8-80M離心機(jī)（Beckman），N-EVAP111氮吹儀（Organomation），Waters600E配自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（Waters 2487紫外檢測(cè)器）。

1.3 動(dòng)物及分組給藥 Wistar大鼠40只，購自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（津）2009-0001。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、壯骨1號(hào)方組和壯骨2號(hào)方組，每組10只，雌雄各半。3個(gè)給藥組按2.1 g/kg連續(xù)灌胃7 d，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的飲用水，末次給藥后24 h斷頭處死大鼠并取肝臟。

1.4 肝微粒體的制備及體外肝微粒體體系的建立 大鼠斷頭處死，用生理鹽水從肝門靜脈沖洗肝臟至土黃色，取肝臟1 g用3 mL Tris-HCI緩沖液勻漿。按照文獻(xiàn)[5]方法離心獲得肝微粒體，所得肝微粒體用K2HPO4緩沖液重懸。肝微粒體懸液于-80℃保存。

體外肝微粒體體系的建立參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，體系中cocktail探針底物氨苯砜、非那西丁濃度均為2 μg/mL，奧美拉唑、氯唑沙宗濃度均為4 μg/mL。反應(yīng)1 h后加入CH2Cl2終止反應(yīng)，并加入甲硝唑內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合，5 000 r/min離心5 min，取有機(jī)相氮?dú)獯蹈?，用甲醇?fù)溶后進(jìn)樣。

1.5 高效液相色譜法（HPLC）條件及方法學(xué)考察 Waters600E配自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)（Waters 2487紫外檢測(cè)器），Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）色譜柱，柱溫25℃，流動(dòng)相為乙腈∶水（醋酸銨）=32∶68，流速1．0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm。

以探針峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)與探針濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。取8．0、2．0、0．5 μg/mL 3個(gè)探針混合濃度，每個(gè)濃度5個(gè)樣計(jì)算其回收率，每一濃度測(cè)5次計(jì)算日內(nèi)精密度，每一濃度連續(xù)測(cè)定3 d計(jì)算日間精密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS17．5軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 肝微粒體本身對(duì)所選探針及內(nèi)標(biāo)并無明顯干擾，各個(gè)底物和內(nèi)標(biāo)均可以較好的分離，保留時(shí)間也較為適中，見圖1。

圖1 典型肝微粒體HPLC圖Fig.1 Typical HPLC chromatogram of liver microsome

1）氨苯砜的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y^= 0．841 5X+0．023 1，相關(guān)系數(shù)r=0．997 7，線性范圍0．5～8．0 μg/mL，回收率在94．06%～101．39%，日內(nèi)精密度RSD為2．94%～5．16%，日間精密度RSD為4．76%～9．43%。

2）非那西丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y^= 0．5037X+0．1288，相關(guān)系數(shù)r=0．996 8，線性范圍0．5～8．0 μg/mL，回收率在93．35%～103．46%，日內(nèi)精密度RSD為3．68%～7．04%，日間精密度RSD為4．37%～8．63%。

3）奧美拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y^= 0．8130X+0．2144，相關(guān)系數(shù)r=0．999 3，線性范圍0．5～8．0 μg/mL，回收率在94．76%～99．26%，日內(nèi)精密度RSD為2．45%～8．76%，日間精密度RSD為5．88%～9．81%。

2.2 壯骨關(guān)節(jié)丸及2個(gè)新工藝對(duì)P450的影響 cocktail探針在體外肝微粒體系統(tǒng)中代謝1 h后，對(duì)照組大鼠肝微粒體代謝探針中氯唑沙宗29．6%、非那西丁37．0%、氨苯砜20．7%、奧美拉唑32．6%。壯骨關(guān)節(jié)丸及其2個(gè)新工藝的給藥組大鼠肝微粒體體外對(duì)氯唑沙宗的代謝能力降低，剩余氯唑沙宗濃度顯著升高，與對(duì)照組相比壯骨關(guān)節(jié)丸組代謝減少36．1%、壯骨1號(hào)方組代謝減少55．2%、壯骨2號(hào)方組代謝減少42．1%，而非那西丁、氨苯砜、奧美拉唑濃度與對(duì)照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 肝微粒體系統(tǒng)中代謝1 h后Cocktail探針的濃度Fig.2 Concentrations of Cocktail probes in liver microsomes system after metabolism for 1 h

3 討論

cocktail探針中氯唑沙宗、非那西丁、氨苯砜、奧美拉唑分別為CYP2E1、CYP1A2、CYP3A及CYP2C19的特異性底物[7]，考察cocktail探針在大鼠肝微粒體系統(tǒng)中的代謝可以反應(yīng)出4個(gè)P450酶亞型的活性，雖然研究認(rèn)為大鼠的多探針實(shí)驗(yàn)與單探針實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在一定差異[8]，但這并不影響判斷藥物對(duì)P450的誘導(dǎo)和抑制作用，同時(shí)可以避免體內(nèi)影響因素較多的問題[9]。實(shí)驗(yàn)選擇在連續(xù)給藥7 d，末次給藥后24 h取肝臟制備肝微粒體，可以考察長(zhǎng)期用藥后細(xì)胞色素P450活性的變化而且讓受試藥本身盡量代謝掉，從而減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，新工藝并未改變壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)細(xì)胞色素P450的影響，壯骨關(guān)節(jié)丸及壯骨1號(hào)方、壯骨2號(hào)方連續(xù)用藥抑制了大鼠CYP2E1的活性，而對(duì)CYP1A2、CYP3A及CYP2C19無顯著影響。

壯骨關(guān)節(jié)丸含有熟地黃、乳香、沒藥、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、獨(dú)活、骨碎補(bǔ)、桑寄生、木香、續(xù)斷、狗脊、雞血藤共12味藥材，有研究認(rèn)為淫羊藿苷可以抑制CYP2E1而誘導(dǎo)CYP1A1和CYP3A[10]，課題組前期研究表明，乳香、沒藥可以誘導(dǎo)CYP1A2、CYP2E1活性增強(qiáng)而對(duì)CYP3A無顯著影響[6]，研究表明補(bǔ)骨脂對(duì)P450也有一定影響，但報(bào)道的結(jié)果并不完全一致，體外肝微粒體研究[11]表明補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)CYP1A2和CYP2D6有抑制作用而對(duì)CYP3A有誘導(dǎo)作用，而對(duì)HepG2細(xì)胞的研究[12]中CYP1A1和CYP3A4均呈現(xiàn)抑制作用。而且更多的藥材并無P450相關(guān)的研究報(bào)道，目前很難界定壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)CYP2E1的抑制到底是哪些藥材的綜合結(jié)果。

CYP2E1約占P450總量的7%，目前的研究證實(shí)CYP2E1的底物多達(dá)75種，其中大部分為前致癌物和前毒物，少部分為藥物。骨性關(guān)節(jié)炎為中老年人多發(fā)病，可能會(huì)聯(lián)合使用的降脂藥、降壓藥大多數(shù)不經(jīng)過CYP2E1代謝，如辛伐他丁、洛伐他丁、阿托伐他汀、硝苯地平、非洛地平主要由CYP3A4代謝，而氟伐他丁主要經(jīng)CYP2C9代謝[11]，而壯骨關(guān)節(jié)丸及其新工藝對(duì)CYP3A活性并無顯著影響，CYP2E1主要負(fù)責(zé)異煙肼、對(duì)乙酰氨基酚和氯唑沙宗等臨床藥物的代謝，同時(shí)CYP2E1可活化四氯化碳、硫代乙酰胺等肝毒物和苯、苯乙烯、氯乙烯和三氯乙烯等前致癌物[12]，這些藥物或毒性前成分是經(jīng)過CYP2E1代謝而生成的代謝產(chǎn)物有毒性，而壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)CYP2E1顯示為抑制作用并不會(huì)導(dǎo)致這些藥物或毒性前成分的毒性增強(qiáng)，提示壯骨關(guān)節(jié)丸與這些藥物同時(shí)使用不會(huì)導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，聯(lián)合用藥是較為安全的。

[1]姜 雋.玻璃酸鈉合壯骨關(guān)節(jié)丸治療膝骨關(guān)節(jié)炎149例療效觀察[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床,2008,8(3):36-37.

[2] 章建華,章 權(quán),朱 希,等.健膝壯骨方對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因P53、Bcl-2表達(dá)作用的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(11):2437-2439.

[3] 國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心.藥物不良反應(yīng)信息通報(bào)（第16期） [EB/OL].http://www.sfda.gov.cn/WS01/CL0078/32614.html, 2008-08-09.

[4]周 昆,代 志,柳占彪,等.壯骨關(guān)節(jié)丸中肝毒性藥材的篩選研究[J].中國(guó)藥物警戒,2009,6(11):641-648.

[5]魏 偉,吳希美,李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010.

[6]周 昆,朱桃桃,馬志會(huì),等.乳香沒藥對(duì)細(xì)胞色素P450活性的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(22):131-134.

[7] 樊慧蓉.Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)人參皂苷Re對(duì)肝細(xì)胞色素P450酶亞型的影響[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2004.

[8]馬葉濤,俸 珊,趙瑾怡,等.單探針與混合探針底物法在細(xì)胞色素P450酶底物酶促動(dòng)力學(xué)中的比較研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,32(4):206-210.

[9]侯叢頌,楊志宏,孫曉波.cocktail探針?biāo)幬锓捌湓谘芯恐兴帉?duì)細(xì)胞色素P450影響中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013,27(3):445-450.

[10]李利生,陳 瀾,王安斌,等.淫羊藿苷對(duì)不同月齡大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450的影響[J].華西藥學(xué)雜志,2012,27(4):376-378.

[11]鐘玉環(huán)，沈國(guó)林，原 梅，等.補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)體外細(xì)胞色素P450酶活性的抑制和誘導(dǎo)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2012,26(4):522-528.

[12]劉繼新，高慶建，陸 鋮，等.同分異構(gòu)體補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2細(xì)胞及細(xì)胞色素P450酶的影響 [J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2014,29(5):438-441.

[13]鄧萬俊.他汀類藥物與其他藥物的相互作用[J].中藥新藥與臨床藥理,2006,25(2):131-136.

[14]劉 芳,朱新林,陸榮柱.細(xì)胞色素P450 2E1在線粒體的定位功能調(diào)節(jié)因素及其毒理學(xué)意義[J].衛(wèi)生研究,2013,42(4):706-711.

Influence of Zhuanggu Guanjie pill on liver microsome cytochrome P450 in rats

ZHOU Kun1,ZHU Tao-tao1,ZHANG Yue1,DAI Zhi2
（1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae,Ministry of Education,Institute of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.R&D Center of Sanjiu Medical&Pharmacutical Co.Ltd,Shenzhen 518110,China）

[Objective]To investigate the influence of Zhuanggu Guanjie pill(ZGGJ)on liver microsome cytochrome P450 in rats. [Methods]Rats were administered intragastrically with ZGGJ and their two new technologic products（crude drug,2.1 g/kg）once a day for 7 days.The 24 hours after the last administration,rats were sacrificed and liver microsomes were prepared by calcium sedimentation. CYP3A,CYP1A2,CYP2C19,CYP2E1 activity of liver microsomes,including dapsone,phenacetin,omeprazole and chlorzoxazone were detected by cocktail probe in vitro.[Results]Cocktail probes were metabolized in liver microsomes system for 1 h.Chlorzoxazone concentration of administrated groups,including ZGGJ and their two new technologic products groups was significantly higher than control group.There was no significant difference of omeprazole,phenacetin,dapsone concentrations between administrated groups and the control group.[Conclusion]ZGGJ can inhibit CYP2E1 activity,but has no significant effect on CYP1A2,CYP3A and CYP2C19 in rats.

Zhuanggu Guanjie pill;cytochrome P450;CYP1A2;CYP2E1;CYP2C19;CYP3A

R285.5

A

1672-1519（2014）11-0690-03

2014-05-23）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.14

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)（2011ZX09201-201-21）。

周 昆（1978-），男，助理研究員，主要從事中藥毒性及減毒研究。