金月玲Ui-Soon Khoo戴振聲

(1上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥系 上海 200237；2香港李嘉誠醫(yī)學(xué)院瑪麗醫(yī)院病理科 香港；3復(fù)旦大學(xué)附屬上海市浦東醫(yī)院血液科 上海 201399)

組織列陣檢測技術(shù)（TMA）制作組織切片過程中的問題分析和改進

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(1上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥系 上海 200237；2香港李嘉誠醫(yī)學(xué)院瑪麗醫(yī)院病理科 香港；3復(fù)旦大學(xué)附屬上海市浦東醫(yī)院血液科 上海 201399)

目的本文介紹組織列陣檢測技術(shù)(tissue microarray technology,TMA)制作組織切片的程序,闡述TMA檢測技術(shù)的操作經(jīng)驗和改進方法。方法收集147例乳腺癌標本(香港瑪麗醫(yī)院提供),采用TMA技術(shù)制備石蠟切片。詳述制作TMA石蠟切片的過程并分析和解決制作過程中出現(xiàn)的各種問題。結(jié)果TMA技術(shù)可以將數(shù)百個組織整齊排列在同一個受體蠟塊上,使多種腫瘤基因在一張TMA切片上同時進行檢測。乳腺癌組織陣列整齊,微組織塊無明顯脫失,有小部分折疊,組織形態(tài)基本保存完好。結(jié)論通過防止和改進在制作過程中出現(xiàn)的問題,可成功制備TMA蠟塊,為后期基因表達及功能的檢測提供了技術(shù)保障。

組織列陣檢測技術(shù)(TMA)； 分子生物學(xué)技術(shù)； 乳腺癌

組織列陣檢測技術(shù)(tissue microarray technology,TMA)是通過一個簡單的手動操作的實驗室儀器完成的組織檢測技術(shù),它可以將數(shù)十、數(shù)百乃至數(shù)千個小的組織整齊地排列在一個蠟塊上,由多個高密度排列的0.6～3.0 mm的蠟芯組成。制成切片后,多個單獨的組織樣本可同時在一張玻璃片上進行基因的分析和表達,一次實驗即可獲得大量信息。這大大節(jié)約了組織原材料和檢測試劑,減少了實驗誤差,增強了可比性,簡化了操作,TMA技術(shù)為從基因功能研究走向臨床實踐提供了捷徑。本文重點介紹在香港李嘉誠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系學(xué)習(xí)組織芯片構(gòu)建的過程和體會,探討在切片制作過程中如何提高TMA的切片成功率,包括制作石蠟切片的改進方法、分析和解決切片過程中應(yīng)注意的問題等。

材料和方法

標本來源收集1996年1月至2005年12月間香港瑪麗醫(yī)院外科送檢的病理標本,經(jīng)臨床及病理HE染色確診為乳腺癌,共計147例。

標本準備所有標本經(jīng)4%甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色,經(jīng)臨床及病理檢查確診為乳腺癌。在切片上面畫圈標記病變的切片部位,收集對應(yīng)的組織蠟塊作為供體蠟塊,整理臨床資料。

儀器TMA儀器,直徑2.0和0.6 mm組織打孔針(Beecher Instruments),切片機(德國MICROM公司)。

制作組織芯片

準備供體蠟塊和HE染色切片 供體蠟塊至少有1 mm厚,厚度最好為3～4 mm。判斷每個供體蠟塊對應(yīng)的新鮮的HE染色切片,用圈或點標記取樣部位。

制備受體蠟塊 受體蠟塊通過熔化常規(guī)的石蠟(熔點溫度55～58℃)澆注到模具中,制成空白蠟塊,過程中避免形成氣泡。模具的大小可根據(jù)列陣點的多少而定,模具厚度為5～10 mm。

受體蠟塊與供體組織蠟芯的制備與融合

TMA儀器有2個打孔針,直徑分別為2.0和0.6 mm。0.6 mm打孔針用來制備受體蠟孔,即用打孔針在受體蠟塊上沖擊一個孔,將空白組織芯推出,在受體蠟塊上留下空白孔；再用2.0 mm打孔針在供體蠟塊的標記部位打孔,采集組織芯,將需要的供體組織芯推入受體蠟塊的空洞中,于是供體蠟塊的組織芯成功植入到受體蠟塊的空白孔中。由于受體蠟塊的組織芯直徑比供體蠟塊的孔徑小,因此兩者結(jié)合緊密,不留空隙。根據(jù)樣本的多少,制備下一個組織芯,整齊排列在同一個受體蠟塊上。兩個打孔針的移動和定位可以通過調(diào)節(jié)儀器的螺絲來完成,因此在制作受體蠟塊的空白孔及融合供體的組織芯時,一定要轉(zhuǎn)換打孔針。完成兩者融合后,再將打孔針調(diào)節(jié)控制旋鈕到下一個組織陣點。每個標本制作3個組織芯,并列排列。

制作石蠟切片 常規(guī)石蠟切片之前,確保列陣蠟塊的平面光滑平坦。將蠟塊放置在37℃保溫箱中10～15 min,使蠟塊中的組織芯與孔壁緊密結(jié)合,然后用一張清潔的顯微鏡載玻片壓在列陣蠟塊的表面,均勻施壓使所有組織芯在同一個水平面上。修正蠟塊,用冰塊凍結(jié)組織面,連續(xù)切片,厚度為4～5μm,用于免疫組化染色檢測,使用多聚賴氨酸處理過的載玻片以防脫片,常規(guī)制作石蠟切片。

結(jié) 果

本實驗每個組織芯蠟塊切5張切片,載玻片上組織陣列排列整齊,一張用于HE染色,再次確診病理變化,其余用于免疫組化染色或其他分子生物學(xué)檢測(圖1)。HE染色切片結(jié)果與供體切片診斷一致。

討 論

TMA技術(shù)在文獻中有很多介紹,本文介紹的這種技術(shù)操作相對簡單,其在香港李嘉誠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系的實驗室被廣泛用于多項分子病理學(xué)檢測。

1986年,Battifora［1］首先提出了多腫瘤組織蠟塊(multitumor tissue block,MTTB)的制作技術(shù),即將多個組織標本經(jīng)手工組合,重新排列包埋蠟塊,即在一個正常大小的蠟塊上嵌入100個或更多不同的組織樣本。MTTB允許在一張切片上用一滴抗體檢測大量的組織樣本。1998年,Kononen等［2］提出了組織芯片或稱組織微陣列(tissue microarrays)的概念,開發(fā)了基于陣列方式的高通量技術(shù),將直徑0.6 mm的乳腺癌小組織樣本,以陣列方式排列包埋于同一塊20 mm×45 mm的石蠟塊中,然后進行切片,即將數(shù)十個甚至數(shù)千個不同個體的圓柱型組織集中在一張載體上,形成組織微陣列生物芯片。隨后,這項技術(shù)得到了改進和應(yīng)用,主要用于生物標志物的鑒定、識別和驗證,尤其是從實驗室研究到臨床驗證會很大程度上依賴于組織芯片技術(shù)與自動化定量分析技術(shù)的結(jié)合［3-4］。在一些樣本量大、可重復(fù)性要求高的領(lǐng)域,如分子流行病學(xué)［5］、細胞遺傳學(xué)［6］等,類似的TMA技術(shù)必不可少。國內(nèi)亦有實驗室構(gòu)建了各種混合性腫瘤的芯片,并采用HE染色和免疫組化對多種抗體進行檢測［7］。

針對制作切片過程中的常見問題,我們提出了相應(yīng)的解決方法,并進行操作技術(shù)上的改良：(1)供體組織芯沒有準確進入受體空洞中,這時要檢查是否移動了載物臺,或打孔針是否彎曲。(2)供體組織芯不易取出,這時應(yīng)更換新的針頭,因為針頭可能被堵住了。(3)供體組織芯推入受體空洞時太深,導(dǎo)致陣列平面凹進,這時要用小的打孔針鉆掉該組織芯,然后在相同位置重新放入標本。(4)融合完成的蠟塊表面不平,尤其是中央會凸起,這是由于蠟塊表面排列大量樣本時組織芯密度太高、樣本間距太小造成的?？梢酝ㄟ^減少供體組織芯的數(shù)量或加深受體空洞來解決。還有一種補救的辦法是：將融合好的凸凹不平的蠟塊放入37℃的保溫箱中靜置15 min,當(dāng)蠟塊變軟時,用一張干凈的玻璃片蓋在表面,輕輕按壓,直到表面平坦為止。

在制作TMA組織列陣蠟塊過程中,最常見的問題就是供體組織芯沒有準確地進入受體空洞中。我們建議：(1)可以將受體蠟塊事先制作成排列整齊的空洞,這樣就可以防止在多次轉(zhuǎn)換打孔的過程中移動載物臺,導(dǎo)致受體蠟芯未能準確植入到供體空洞中；同時由于提前制作受體蠟塊,還可大大縮短制作時間。(2)一定要保證受體蠟塊的質(zhì)量,要求蠟塊韌性好、質(zhì)地軟,否則在打孔和植入的過程中容易碎裂或使打孔針彎曲。

制作成功的組織列陣蠟塊可以用于免疫組化檢測、HE染色、HC、ISH、熒光原位雜交(FISH)、原位雜交、TUNEL檢測細胞凋亡等分子病理學(xué)檢測。組織芯片將眾多樣本放在同一切片上,減少了分批、分次實驗造成的實驗誤差,同化了實驗條件,節(jié)約了實驗試劑和操作時間。TMA所用樣本的組織量少,剩余組織破壞性小,標本可繼續(xù)用作其他檢測。根據(jù)不同需要可設(shè)計同一腫瘤或多種腫瘤的組織芯片,以進行一種或多種腫瘤的分子生物學(xué)標記。

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因、多步驟的復(fù)雜過程,至今未被完全了解,部分原因是由于缺少高通量的分析技術(shù)。盡管大量新的基因和基因改變不斷被提出,但是這些分子標志物在臨床腫瘤診斷、預(yù)后和治療中的意義還需要TMA這樣的高通量檢測方法加以驗證。

［1］ Battifora H.The multitumor(sausage)tissue block：novel method for immunohistochemical antibody testing［J］.Lab Invest,1986,55(2)：244-248.

［2］ Kononen J,Bubendorf L,Kallioniemi A,et al.Tissue microarrays for high throughput molecular profiling of tumor specimens［J］.Natl Med,1998,4(7)：844-847.

［3］ Giltnane JM,Rimm DL.Technology insight：Identification of biomarkers with tissue microarray technology［J］.Nat Clin Pract Oncol,2004,1(2)：104-111.

［4］ Brennan DJ,Kelly C,Rexhepaj E,et al.Contribution of DNA and tissue microarray technology to the identification and validation of biomarkers and personalised medicine in breast cancer［J］.Cancer Genomics Proteomics,2007,4(3)：121-134.

［5］ Vernon SD,Whistler T.Microarray technology for use in molecular epidemiology［J］.Methods Mol Biol,2007,382：97-113.

［6］ Bejjani BA,Shaffer LG,Ballif BC.The use of microarray technology for cytogenetics［J］.Methods Mol Biol,2010, 632：125-139.

［7］ 陳水平,丁毅,高美欽.一種簡易的免疫組織化學(xué)陽性對照新方法［J］.中華病理學(xué)雜志,2006,35(11)：693-694.

problem analysis and improvement on making tissue sections using tissue microarray technology（TMA）

JIN Yue-ling1,Ui-Soon Khoo2,DAI Zhen-sheng3△
(1Department of Biomedicine,Shanghai Academy of Health Sciences,Shanghai 200237,China；2Department of Pathology,The University of Hong Kong,Queen Mary Hospital,Hong Kong；
3Department of Hematology,Shanghai Pudong Hospital,Fudan University,Shanghai 201399,China)

Objective To introduce an array-based high-throughput and simple-operated technique named tissue microarray technology(TMA),also to analysis the problems and the improvement in the process.MethodsWe collected 147 case specimens of breast cancer from Queen Mary Hospital of Hongkong for TMA detection.We described the process of the TMA operation in detail,and analyzed the troubleshooting that may happen in TMA process.ResultsHundreds of tissues were arrayed at a high density on one block and the specimens were neatly arrayed,the tissue appeared small part folded with the morphological characteristics being well preserved.ConclusionsBy preventing the problems and making improvement in the process,TMA block of wax can be successfully organized, which provides the possibility to widely investigate gene expression and function in clinical practice.

tissue microarray technology(TMA)； molecular biology techniques； breast cancer

Q-336

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.020

2013-02-01；編輯：王蔚)

上海市衛(wèi)生局科研課題(2010052)

△Corresponding author E-mail：zhenshengdai@yahoo.com.cn

*This work was supportedby the project of Shanghai Municipal Health Bureau(2010052).