邢 岳王紓宜△許祖德

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200031；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科 上海 200040)

Skp2在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

邢 岳1王紓宜1△許祖德2

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200031；2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科 上海 200040)

目的探討Skp2與鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的預(yù)后及其他臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系。方法收集95例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者臨床病理學(xué)資料,用免疫組化方法檢測腫瘤石蠟包埋標(biāo)本的EB病毒編碼RNA(EBV encoded RNA,EBER)、Skp2及Ki-67的表達(dá)情況,將Skp2陽性細(xì)胞比率超過50%的病例計(jì)入高表達(dá)組,低于50%的計(jì)入低表達(dá)組,分析患者的預(yù)后、EBER表達(dá)狀態(tài)與Skp2、Ki-67表達(dá)率之間的關(guān)系。結(jié)果在Skp2高表達(dá)組,中位生存期為20.54個(gè)月(95%CI：18.49-22.59),1年總體生存率為76%；在Skp2低表達(dá)組,中位生存期為17.54個(gè)月(95%CI：20.31-22.24),1年總體生存率為71%；在Skp2陰性組,中位生存期為個(gè)21.71個(gè)月(95%CI：11.15-16.18),1年總體生存率為91%。生存分析顯示,Skp2高表達(dá)組與Skp2陰性組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。結(jié)論Skp2的高表達(dá)可能是鼻腔NK/T細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后的不良因素。

Skp2； Ki-67； EB病毒編碼RNA(EBER)； 鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤

鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤(nasal type natural killer/T-cell lymphoma,NKTCL)是一種特殊類型的非霍奇金惡性淋巴瘤,其腫瘤組織常侵犯鼻腔和上呼吸道和消化道,預(yù)后較差［1-2］。鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤在歐美國家罕見,而在亞洲、墨西哥及南美洲地區(qū)相對(duì)多見。據(jù)報(bào)道,其在亞洲的發(fā)病率占到非霍奇金惡性淋巴瘤的2.6%～10.7%,占鼻咽部腫瘤的40%～70%。這很可能與EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染的地理分布特點(diǎn)有關(guān)［3］。

鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病與EB病毒感染有密切的關(guān)系,與鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤相似,其EB病毒表現(xiàn)出Ⅱ型潛伏感染的特征,EB病毒的致瘤機(jī)制至今仍未完全闡明。一些研究發(fā)現(xiàn)：EB病毒通過與泛素蛋白酶系統(tǒng)的相互作用來維持其潛伏感染,并且活化特定癌基因,使得泛素依賴性蛋白降解系統(tǒng)失效［3-4］。

S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)屬于F-box蛋白家族,由F-box序列、Linger序列及亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(Leucinerich-repeat,LRR)組成。Skp2則可以特異性識(shí)別并降解SCF(skp-cullin-F-box蛋白)復(fù)合體磷酸化底物P27,介導(dǎo)泛素化降解,調(diào)控細(xì)胞周期［5］。Skp2同時(shí)也是一種與淋巴瘤發(fā)生有關(guān)的癌基因［6］。P27是關(guān)鍵的細(xì)胞素依賴性激酶抑制子,可以在G1/S檢查點(diǎn)阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展。先前報(bào)道指出,P27的下調(diào)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān),包括結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌。

近期,一些研究指出某些EB病毒編碼的蛋白可以調(diào)節(jié)Skp2依賴性泛素化,并且破壞哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的P27蛋白。這一證據(jù)提示鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的EB病毒潛伏感染可能導(dǎo)致Skp2與P27蛋白表達(dá)的失衡,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Ki-67是一種與核增殖相關(guān)的抗原,表達(dá)于細(xì)胞周期的生長期與合成期,在G0期(靜息期)不表達(dá)［7］。盡管在既往研究中Ki-67的標(biāo)記指數(shù)從4%～22%不等,但它仍為一種可靠的細(xì)胞增殖標(biāo)記物［8］。

關(guān)于Skp2在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的表達(dá),其與EB病毒編碼RNA(EBV encoded RNA,EBER)表達(dá),以及腫瘤的預(yù)后相關(guān)性,目前尚不清楚。本次研究通過免疫組化的方法,探討鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中Skp2和EBER的相關(guān)性,并進(jìn)一步研究聯(lián)合檢測Skp2和Ki-67對(duì)于預(yù)后的指導(dǎo)意義。

材料和方法

研究對(duì)象選取從2011年1月1日至2011年12月31日在復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院確診的、有完整臨床病例資料且腫瘤組織充分的95例(鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤)納入研究。所有病例均經(jīng)2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生作出診斷。

免疫組化染色（Skp2、ki67） 活檢標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋。免疫組化染色依照Envision兩步法,石蠟標(biāo)本經(jīng)脫蠟,梯度乙醇脫水、血清孵育后,滴加相應(yīng)一抗,50μL/片,室溫下孵育1 h,4℃放置過夜,室溫平衡15 min,0.05 mol/L PBS(p H7.6)洗滌5 min×3次,滴加兩步法檢測系統(tǒng)En VisionTM/HRP)于組織上,50μL/片,37℃1 h。用PBS沖洗切片。Skp2陰性對(duì)照采用PBS,陽性對(duì)照采用扁桃體組織。Skp2主要定位于胞核,少數(shù)定位于胞質(zhì)。每例切片均在高倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。Skp2陽性細(xì)胞比率超過50%的病例被計(jì)入高表達(dá)組中,低于50%的計(jì)入低表達(dá)組中［9］。Ki-67陰性對(duì)照采用PBS,Ki-67定位于胞核,每例切片均在高倍鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。Ki-67陽性細(xì)胞比率超過50%的病例被計(jì)入高表達(dá)組中,低于50%的計(jì)入低表達(dá)組中。所有陽性細(xì)胞均經(jīng)2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生雙盲計(jì)數(shù)。

原位雜交檢測EBER標(biāo)本脫蠟水化后,用25 μg/m L的蛋白酶K(Merck公司產(chǎn)品),37℃消化10 min,水洗,根據(jù)標(biāo)本大小,每片滴加10～20μL雜交液,蠟?zāi)じ采w,橡膠水封邊,70℃變性8 min,37℃雜交過夜。在室溫下各洗脫10 min×2次,去除未雜交信號(hào)。設(shè)置雜交液中無標(biāo)記探針為陰性對(duì)照。參照Dig-DNA標(biāo)記和檢測試劑盒(Boehringer Mannheim公司,Cat.No.1093657)的方法檢測。2%的正常羊血清室溫封閉20 min后,用BufferⅠ1∶2 000稀釋的地高辛抗體37℃孵育30 min, BufferⅠ洗3次,每次5 min；BufferⅢ中浸泡5 min后,加BufferⅢ稀釋的NBT/BCIP顯色液30 m L,暗濕盒中顯色1～3 h,緩沖液Ⅳ終止反應(yīng),空氣晾干,4℃保存。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素生存分析采用Kaplan Meier法評(píng)估生存可能性,采用Log-rank分析意義。相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床病理學(xué)特征共有95例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤納入研究,其人口和年齡組成、腫瘤生長部位及臨床病理學(xué)特征如下：男性71例,女性24例,男女比例為2.9∶1；年齡為16～86歲(只有1例為20歲以下),平均(55±15.37)歲,其中67例腫瘤生長位于鼻腔,13例位于鼻咽處,11例位于咽喉部；共有76例患者感染EB病毒,感染率為80%。我們對(duì)所有的病例進(jìn)行1年隨訪,失訪患者26例。所有95例患者均進(jìn)行了HE、Skp2、Ki-67和EBER免疫組化染色(圖1),其中Skp2的陽性率為44%,Ki-67的陽性率為99%,確診時(shí)共有63例的血清LDH水平,其中53例為正常,10例升高。

單因素生存分析利用Kaplan Meier法分別對(duì)性別、年齡(≤60歲和＞60歲)、部位、Skp2的表達(dá)程度(高、低)、Ki-67的表達(dá)程度(高、低、陰性)、EB的感染(陽性、陰性)以及LDH(升高、正常)進(jìn)行了生存分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與Skp2陰性組相比,Skp2的高表達(dá)提示預(yù)后不良(χ2=6.770,P=0.035),年齡＞60歲組的預(yù)后不良(χ2=5.076,P=0.025),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余因素未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、圖2)。

Skp2與EBER的相關(guān)性分析我們對(duì)Skp2表達(dá)高低、EBER以及Ki-67進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析。發(fā)現(xiàn)Skp2表達(dá)與Ki-67呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.290,P=0.011),而與EBER無顯著的相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)為0.115,P=0.264,表2)。

討 論

Skp2由Demetric于1995年通過熒光原位雜交法發(fā)現(xiàn),它是一種核蛋白,也是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Skp2包括一個(gè)F盒、10個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列及一個(gè)C末端的模體,是SCF(Skp1-Cullin-F-box,SCF)復(fù)合物的底物識(shí)別亞單位,能夠識(shí)別并降解P27,后者的下調(diào)與多種腫瘤的預(yù)后相關(guān)［10-13］。

細(xì)胞周期失控在腫瘤的發(fā)生中有一定的意義,而Skp2是介導(dǎo)泛素化降解,調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白。之前的研究指出Skp2與一些惡性腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),在這些腫瘤中,Skp2的表達(dá)程度是獨(dú)立預(yù)后因素。這些研究的主要對(duì)象是上皮性腫瘤,包括喉癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、泌尿道移行上皮癌以及一些軟組織肉瘤［14-18］。近些年來,研究者開始探討Skp2的表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤,主要是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤及白血病的預(yù)后關(guān)系［19-21］。研究表明,Skp2的表達(dá)程度與淋巴瘤的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān),在生長相對(duì)緩慢的淋巴瘤中,Skp2的表達(dá)低,而在浸潤性進(jìn)展性淋巴瘤中,Skp2的表達(dá)則相對(duì)較高。在動(dòng)物模型中,也發(fā)現(xiàn)Skp2轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出較高的腫瘤發(fā)生率,其存活時(shí)間降低。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們收集的患者皆為鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤,結(jié)果顯示,Skp2高表達(dá)組患者的預(yù)后較Skp2陰性組患者的預(yù)后差,這一點(diǎn)與之前研究所指出的Skp2的表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤進(jìn)展相關(guān)的觀點(diǎn)一致,也為Skp2的高表達(dá)是結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤的不良預(yù)后因素這一觀點(diǎn)提供了更有力的證明。之前的研究發(fā)現(xiàn)Skp2高表達(dá)組淋巴瘤患者的預(yù)后較Skp2低表達(dá)組淋巴瘤患者的預(yù)后差,在本次實(shí)驗(yàn)中,我們并未發(fā)現(xiàn)這樣的差異,部分原因可能是因?yàn)镾kp2低表達(dá)組患者的失訪率過高、隨訪時(shí)間有限所致。這一觀點(diǎn)有待于擴(kuò)大樣本量,及臨床病例資料更完備的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

EB病毒感染狀態(tài)與鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病有密切關(guān)系,本研究中,EB病毒的感染率達(dá)到79%。研究發(fā)現(xiàn),EBV編碼蛋白促使依賴于Skp2的泛素化,降低P27的表達(dá),還可介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白E2F1的表達(dá)［22］。E2F1在非霍奇金惡性淋巴瘤中表達(dá),其可以下調(diào)Skp2的表達(dá),與預(yù)后有一定的相關(guān)性［23］。在本研究中,Skp2的表達(dá)率為47%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,與EBER感染狀態(tài)無明顯相關(guān)性,與之前的研究有些出入［24］。造成這一現(xiàn)象的原因可能與隨訪資料的局限性及隨訪時(shí)間不夠長有關(guān),EB病毒感染與Skp2在鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生過程中相互作用的機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

既往研究發(fā)現(xiàn)在胃腸道間質(zhì)瘤及其他一些間質(zhì)性腫瘤中,Skp2與Ki-67表現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性［25-27］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤Skp2與Ki-67的表達(dá)有相關(guān)性(P＜0.025)。在將來的研究中,可以在更龐大、更完整的淋巴瘤臨床病理資料中繼續(xù)查證Skp2表達(dá)與Ki-67及其他惡性細(xì)胞參數(shù)的相關(guān)性,以探索Skp2是否可作為評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度及侵襲性的一種輔助指標(biāo)。

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The expression and clinical significance of Skp2 in nasal type NK/T-cell lymphoma

XING Yue1,WANG Shu-Yi1△,XU Zu-De2
(1Department of Pathology,Eyes,Ears,Nose and Throat Hospital,Fudan University,Shanghai 200031,China；
2Department of Pathology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China)

Objective To discuss the correlation between Skp2 and the prognosis and other clinicopathological features of nasal type NK/T-cell lymphoma.MethodsWe collected the clinicopathological data of 95 cases of nasal type NK/T-cell lymphoma,detected the expression of EBV encoded RNA(EBER),Skp2 and Ki-67 of paraffin-embedded tissue of tumors using immunohistochemical method.The cases with the Skp2-positive rate of tumor cells above 50%were classified into high expression group,those with below 50%were classified into low expression group. We analyzed the correlation between the expression of Skp2 and Ki-67,and the prognosis or EBER status.ResultsIn the high expression group,the mean overall survival was 20.54 months(95%CI：18.49-22.59),the 1-year overall survival rate was 76%.In the low expression group,the mean overall survival was 17.54 months(95%CI：20.31-22.24),the 1-year overall survival rate was 71%.In the negative expression group,the mean overall survival was 21.71 months(95%CI：11.15-16.18),the 1-year overall survival rate was 91%.There was statistical difference between Skp2 high expression group and Skp2 negative expression group(P＜0.01).ConclusionsThe high expression of Skp2 maybe an independent unfavorable prognosis factor of nasal type NK/T-cell lymphoma.

Skp2； Ki-67； EBV encoded RNA(EBER)； nasal type NK/T-cell lymphoma

R 73

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.010

2013-03-29；編輯：張秀峰)

△Corresponding author E-mail：sywangsh@hotmail.com