曾健，陳敏，2＊，鄭敏芳，邱雨生，2

（1.廈門大學 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005；2.近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，福建 廈門 361005）

1 引言

固氮速率和反硝化速率的相對平衡，決定了海洋無機氮儲庫的大小，直接影響著海洋生態(tài)系統(tǒng)的生物泵效率乃至海洋吸收大氣CO2的能力［7］。諸多古海洋沉積記錄已證明，在地質(zhì)歷史時期，海洋的固氮作用和反硝化作用相對強弱發(fā)生著周期性的變化［8—10］，并且與地球氣候的波動密切相關(guān)［3，11—12］。學術(shù)界對現(xiàn)代海洋固氮速率和反硝化速率是否平衡一直存在很大爭議［4，13—17］，這也使得海洋氮循環(huán)成為備受關(guān)注的熱點之一。目前的研究結(jié)果認為，海洋由反硝化作用遷出的結(jié)合態(tài)氮通量達到400Tg/a左右［15，18—19］，而海水的反硝化速率約為100Tg/a［9，18］，且主要集中在阿拉伯海和東赤道南、北太平洋等三大氧極小值區(qū)［18］。然而，近年來厭氧氨氧化作用及其他新型脫氮過程的發(fā)現(xiàn)，極大地改變了有關(guān)海洋氮循環(huán)的傳統(tǒng)認識［20—21］，也使得反硝化作用在海洋中的主導地位面臨挑戰(zhàn)［22—25］。因此，準確評估海洋反硝化作用的強度以及相關(guān)的調(diào)控因素，有助于深入了解現(xiàn)代海洋的氮循環(huán)路徑。

基于15N示蹤的同位素配對技術(shù)（Isotope Pairing Technique，IPT），因其快速、靈敏的特點［26］，尤其能夠定性和定量區(qū)分反硝化和厭氧氨氧化過程而被廣泛應(yīng)用于海洋氮循環(huán)研究中［27—30］，也是目前最重要的技術(shù)手段之一。N2是反硝化作用的最終產(chǎn)物，也是分析測試的對象。由于環(huán)境中的空氣具有很高的N2含量，因此，避免樣品被空氣污染是準確定量獲得反硝化速率的關(guān)鍵。15N示蹤測定反硝化速率的實驗過程中，涉及到趕氣、水樣轉(zhuǎn)移、示蹤劑添加、樣品存放等一系列流程，這些都很難避免不會受到空氣背景的污染［31］。尋找一種能夠有效校正空氣背景影響的方法，對于準確定量反硝化速率尤為重要。本研究通過對南海海水反硝化速率測定過程中所獲得的N2及其同位素組成的數(shù)據(jù)進行分析，探索測定過程中空氣的N2背景是否對實測結(jié)果產(chǎn)生了影響，進而提出了校正空氣29N2背景影響的方法，通過對實際海水樣品的分析，驗證所提出校正方法的可行性。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

2012年8—9月期間，搭載“實驗3號”科學考察船，采集南海中心海盆（10°～18°N，110°～118°E）300～1 500m深度區(qū)間的海水，運用15N標記示蹤的同位素配對技術(shù)開展反硝化速率的測定。為避免采樣過程中的空氣污染，本實驗在鄭敏芳［32］研究的基礎(chǔ)上加以改進，即由CTD－Rossett采水器采集的海水先用乳膠管引出并注入到250cm3玻璃瓶內(nèi)［33］，乳膠管的出水口始終保持在液面下方1cm左右處，待水樣溢流3倍采樣瓶體積后，旋緊瓶蓋，在室溫下避光存放。每個層位采集了雙份平行樣。

2.2 水樣的趕氣和轉(zhuǎn)移

對每個層位所采集的兩份水樣分別進行預先趕氣和不趕氣處理［32］。取其中一份水樣，將一支通有高純He氣（純度99.999%）的15cm長不銹鋼針穿過帶硅膠墊的瓶蓋插至瓶底，同時在硅膠墊上扎一個小針頭以排出空氣，吹掃30min。將吹掃、趕氣后的水樣通過高壓He氣轉(zhuǎn)移至10支預先用高純He氣吹掃過的12.5cm3帶橡膠墊密封培養(yǎng)瓶內(nèi)（Labco Exetainer，Wycombe，UK），頂空部余留4cm3體積。另一份水樣不做高純He預先的趕氣處理，以相同的方法轉(zhuǎn)移至10支密封的培養(yǎng)瓶內(nèi)。所采用的這種培養(yǎng)瓶也是目前國內(nèi)外研究中最為廣泛采用的培養(yǎng)瓶［23—30，32—33］。

2.3 水樣的培養(yǎng)實驗

用微量進樣針將0.06μmol K15NO3（15N 原子豐度98.50%，上?；ぱ芯吭海┤芤杭尤敫髋囵B(yǎng)瓶內(nèi)，使得培養(yǎng)體系中15N的豐度約為20%，此過程培養(yǎng)瓶始終保持密封。每個層位的水樣均設(shè)置5個培養(yǎng)時間段，即0h、48h、72h、96h和120h，每個時間段的樣品設(shè)置了雙份平行樣。在培養(yǎng)的終點，用10μm3飽和HgCl2溶液抑制生物的活性。所有樣品均在采樣后3h之內(nèi)完成培養(yǎng)前的處理，且都在室溫下的無光的水槽中進行。培養(yǎng)結(jié)束后，樣品倒置在室溫水槽內(nèi)密封存放，帶回陸地實驗室進行N2濃度及其同位素組成的分析。

2.4 N2及其同位素組成的質(zhì)譜分析

采用Gas BenchⅡ自動進樣器與DELTAPlusXP穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan，USA）聯(lián)機方式對樣品 的28N2、29N2和30N2同 時 進行測定。分析測試前，先對樣品進行加熱（40℃）超聲處理40min［32］，將溶解在海水中的N2完全驅(qū)趕至培養(yǎng)瓶的頂空部，之后進樣進行測定。樣品從采集到分析間隔1個月左右的時間。分析時采用空氣為標準進行測量，本研究中N2濃度測定的相對標準偏差小于8%［32］。

2.5 反硝化速率的計算

在一個僅存在反硝化作用的培養(yǎng)體系中，加入15N示 蹤 物 后，會 產(chǎn) 生28N2、29N2和30N23種質(zhì)量數(shù)的N2。假設(shè)反硝化細菌隨機利用體系中的14N和15N，那么由生物產(chǎn)生的這3種分子之間的比例關(guān)系與溶液中15N的豐度（即15N濃度占體系N總濃度的份額，用FN表示）有關(guān)［32，34］，可表示為：

因此，通過測定29N2、30N2分子的產(chǎn)生速率，即可計算反硝化速率［33，35］：

其中，Rdeni、R29和R30分別代表反硝化速率、29N2產(chǎn)生速率以及30N2產(chǎn)生速率。后兩者可通過對不同培養(yǎng)時間 段 產(chǎn) 生 的29N2和30N2濃 度 做 線 性 擬 合 得到［23—24］。

3 結(jié)果與討論

3.1 29N2、30N2與28N2峰面積的比較

將所有實驗數(shù)據(jù)的29N2峰面積（Area 29）和30N2峰面積（Area 30）分別對28N2峰面積（Area 28）作圖，發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)點均落在一條直線的上方。若進一步將這些數(shù)據(jù)分為3組：（1）未經(jīng)趕氣處理且不存在反硝化作用的樣品；（2）經(jīng)過趕氣處理但不存在反硝化作用的樣品；（3）存在反硝化作用的樣品，則可明顯看出，前兩組樣品的數(shù)據(jù)都落在一條直線上，而存在反硝化作用樣品的數(shù)據(jù)則離散地分布在直線上方（圖1）。對于不存在反硝化作用的樣品，將未經(jīng)趕氣和經(jīng)趕氣處理的Area 29和Area 28分別進行擬合，可得其關(guān)系分別為y＝0.007 29x＋0.003（r2＝0.998 9，n＝34）和y＝0.007 35x＋0.000 04（r2＝0.999 9，n＝152）；同樣地，對這兩組樣品 Area 30和 Area 28進行線性擬合得到的結(jié)果分別為y＝0.003 44x－0.021（r2＝0.920 0，n＝34）和y＝0.002 81 x－0.004（r2＝0.971 1，n＝152）。上述擬合結(jié)果說明，在沒有反硝化作用發(fā)生的情況下，水樣中所溶存氮氣的29N2/28N2組成相當恒定，且趕氣和未經(jīng)趕氣處理的樣品之間29N2/28N2組成幾乎沒有差異（偏差小于1%），而未經(jīng)趕氣處理的樣品30N2/28N2比值比趕氣處理的30N2/28N2比值來得高，相對偏差大于20%。此前不同學者對采自全球不同區(qū)域的大氣樣品進行過分析，結(jié)果表明，空氣中 N2的15N/14N 比 值 幾 乎 恒定。Junk和Svec對5份來自全球不同海拔地區(qū)的空氣樣品進行了 分 析，其29N2/28N2比 值 平 均 為 0.007 351±0.000 001［36］；Mariotti于不同季節(jié)對環(huán)法國17個地區(qū)的空氣樣品進行分析后指出，δ15N標準偏差小于0.03×10－3，即15N相對豐度的偏差小于1×10－5［37］，說明大氣的15N/14N比值隨時間和空間的變化很小。Berglund和Wieser為國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會（IUPAC）撰寫的“元素同位素組成2009”報告中進一步確定了大氣中15N相對豐度最理想的測試結(jié)果為0.366 3%，換 算 成29N2/28N2的 理 論 比 值 即 為0.007 35［38］。結(jié)合本研究結(jié)果，可以確定空氣中29N2/28N2的比值恒定為0.007 35。

3.2 水樣中N2和30N2峰面積過剩的來源分析

圖1 29 N2、30 N2 和28 N2 峰面積的關(guān)系

空 氣 中15N 的 豐 度 為 0.366%［39—41］。假 設(shè) N2由15N和14N原子隨機組合形成，根據(jù)理論計算，空氣中29N2/28N2的比值應(yīng)為0.007 35，而30N2/28N2的比值應(yīng)為0.000 013 5。比較發(fā)現(xiàn)，不存在反硝化作用的樣品中溶解氣體的29N2/28N2比值與空氣的29N2/28N2理論比值幾乎完全一致，但不存在反硝化作用實測樣品的30N2/28N2比值卻較空氣的理論值高出2個數(shù)量級。在一個15N豐度為20%的培養(yǎng)體系中，若存在反硝化作用，假設(shè)細菌隨機利用14N和15N，且不考慮同位素分餾效應(yīng)，那么實際產(chǎn)生的29N2/28N2和30N2/28N2比值應(yīng)分別為0.5和0.062 5，均遠大于上述實測值。若培養(yǎng)體系中存在厭氧氨氧化作用，由于該過程不產(chǎn)生30N2，故會導致30N2/28N2比值的降低，而不是升高［27］?；谏鲜隹紤]，可以排除生物過程產(chǎn)生過剩30N2的可能性。

為進一步證實這些水樣溶解的N2來自于大氣，取以往不同時間利用實驗周圍空氣所做的標準工作曲線進行對比，可發(fā)現(xiàn)實測得的29N2/28N2比值平均為（0.007 33±0.000 03），與理論值幾乎吻合；而實測得的30N2/28N2比值平均為（0.001 50±0.000 51），同樣較理論值高出2個數(shù)量級，但略低于上述樣品的測定值（圖2）。由此可以說明，研究樣品中確有空氣殘留的N2存在，而且這部分來自于空氣的N2具有30N2顯著“過?！钡奶卣鳌Ｋ畼又袣埩舻腘2可能由于趕氣不充分或者是樣品存放過程中外界空氣的擴散進入。鄭敏芳［32］曾仔細探索過趕氣過程去除培養(yǎng)瓶N2的效率，結(jié)果表明當趕氣時間超過10min后，培養(yǎng)瓶內(nèi)N2濃度低于檢測限，因此水樣中殘留的N2更可能是在樣品長時間存放期間外界空氣的擴散進入。由于實測空氣的29N2/28N2比值與樣品測得的29N2/28N2比值十分接近，說明在外界空氣擴散進入培養(yǎng)瓶時，并未導致28N2和29N2的明顯分餾。

如此，樣品和空氣中“過?！?0N2的存在是否是其它組分干擾的結(jié)果？30N2被質(zhì)譜的離子源轟擊后產(chǎn)生30N離子，核質(zhì)比m/e為30。近些年的研究表明，N2O分子被質(zhì)譜離子源的電子轟擊后會產(chǎn)生NO＋碎片，且與N2O＋離子個數(shù)有恒定的比例關(guān)系［42］。氮、氧 元 素 分 別 以14N（99.637%）和16O（99.757%）豐度最高，故 m/e為30的14N16O＋是主要碎片?？諝庵?N2O的含量約為300×10－9［43］，與 N2含量的比值為4×10－7；海水中溶解N2O平均濃度小于50nmol/kg［43］，僅相當于溶解 N2濃度（500μmol/kg）的萬分之一，顯然，即使樣品或空氣中存在N2O，也無法支持所觀察到的30N2過?，F(xiàn)象。除N2O以外，天然海水或空氣中存在的分子量為30的氣體還包括14N16O、13C17O和12C18O，但它們的含量均遠小于N2含量的百萬分之一［40］，也不可能是產(chǎn)生30N2過剩的主要原因。就目前認識，尚無法清晰界定所觀察到的30N2過剩來源，有待后續(xù)更深入的研究。鑒于30N2存在未知來源的額外影響，本研究在反硝化速率的計算中僅采用29N2測值進行計算，同時重點考慮培養(yǎng)體系中空氣29N2背景的校正方法。

圖2 不同時間空氣 N2 中29 N2、30 N2 和28 N2 的關(guān)系

3.3 29N2峰面積測定結(jié)果的校正

根據(jù)上述討論可知，經(jīng)過培養(yǎng)的水樣或者由于趕氣不夠充分，或是因為存放期間外界空氣的擴散進入，導致樣品中產(chǎn)生了N2背景，這勢必會對反硝化速率的計算結(jié)果產(chǎn)生影響。幸運的是，這部分N2具有恒定不變的29N2/28N2比值，故可利用這一特征信號，對實測的29N2峰面積進行校正，從而準確獲得經(jīng)反硝化作用產(chǎn)生的29N2峰面積。

根據(jù)空氣N2和反硝化作用所產(chǎn)生N2的29N2/28N2比值特征，可建立兩種方法來區(qū)分反硝化作用與空氣對N2的貢獻：

方法一：培養(yǎng)后水樣中的N2包含生物反硝化作用產(chǎn)生和空氣N2背景兩部分。設(shè)由生物反硝化作用產(chǎn)生的28N2、29N2峰面積分別為a1、b1，空氣 N2背景的28N2、29N2峰面積分別為a2、b2；實測的28N2和29N2峰面積分別為A和B。由于空氣N2背景中28N2占絕對主導地位，故可假設(shè)生物反硝化作用產(chǎn)生的28N2相比于背景可忽略（即a1＝0）。另外，由上述討論可知，b2/a2為一恒定比值，用β表示（β＝0.007 35）。由此，可獲得如下質(zhì)量平衡關(guān)系：

求解b1得：

方法二：若考慮生物作用貢獻的28N2，在不存在厭氧氨氧化作用的條件下，假設(shè)反硝化細菌在培養(yǎng)體系中隨機利用14N和15N，且忽略同位素分餾效應(yīng)，那么由反硝化作用產(chǎn)生的29N2/28N2峰面積比值等于2FN/（1－FN）［34］，用α表示，F(xiàn)N為體系中15N/14N豐度比。同樣，可建立如下質(zhì)量平衡方程：

求解b1得：

將兩種校正方法得到的b1值進行對比，發(fā)現(xiàn)二者所得數(shù)據(jù)十分吻合（圖3）。這個結(jié)果也恰好說明上述兩種方法所對應(yīng)的假設(shè)前提在實際培養(yǎng)體系中可以成立，即：（1）由生物反硝化作用產(chǎn)生的28N2與空氣的28N2背景相比可以忽略；（2）研究樣品不存在厭氧氨氧化作用；（3）反硝化作用的同位素分餾效應(yīng)在計算過程中可以忽略。因此，對于只存在反硝化作用的天然水體，利用15N標記示蹤法測定反硝化速率時，可借助式（3）校正空氣N2背景的影響。

在此前的研究中，一些學者有考慮到環(huán)境本底對29N2濃度測定結(jié)果的影響。Dalsgaard等和Nielsen都在各自的研究中提到關(guān)于“過剩29N2”的概念，即生物過程產(chǎn)生的29N2［30，34］，但對計算的方法并未給出具體說明。Holtappels等提出了修正29N2背景干擾的具體方法［33］，但并未給出背景29N2/28N2的特征比值，也沒有考慮厭氧氨氧化作用的存在是否會對校正結(jié)果產(chǎn)生影響。樣品受空氣污染程度與樣品保存的方式和時間長短有關(guān)。多數(shù)國外研究并未涉及29N2背景校正這一方面，可能與樣品的存放方式或存放時間有關(guān)。即便如此，一個合適的校正方法對獲得準確的反硝化速率仍就十分重要［33］，這也是本研究提出可以準確校正15N示蹤所得反硝化速率的初衷所在。

3.4 29N2校正前后反硝化速率的對比

選取本航次分別位于南海海盆北部和南部的兩個站位 KJ12（18°15.12′N，114°0.12′E）和 KJ63（9°59.94′N，111°0.12′E），以氧極小值層位（分別為1 500 m和800m）經(jīng)預先趕氣后水體的培養(yǎng)結(jié)果進行對比。當測定的數(shù)據(jù)未經(jīng)校正處理時，可以明顯地看出平行樣的結(jié)果之間存在較大的偏差，且29N2濃度與培養(yǎng)時間之間不存在顯著的線性相關(guān)性（p＞0.1）（見圖4）。這可能是由于不同培養(yǎng)瓶在放置過程中受外界空氣擴散影響的程度不同所致，導致29N2濃度隨培養(yǎng)時間增加的信號被背景干擾所掩蓋，由此計算得到的反硝化速率將存在很大的不確定度（RSD＞50%）。相比之下，對空氣29N2背景進行校正后，平行樣之間的偏差明顯減小，且29N2濃度與培養(yǎng)時間的線性相關(guān)性水平顯著增加（r2＞0.7，p＜0.001）（圖4），與文獻報道的反硝化作用存在證據(jù)相符［23－24，33］。經(jīng)空氣29N2背景校后得到的反硝化速率不確定度也顯著降低（RSD約為20%）。

就所研究的KJ12和KJ63站氧極小值層位樣品，由式（3）進行空氣29N2背景校正，并由式（1）計算出的反硝化作用潛在速率平均為（1.8±0.2）μmol/（dm3·d）。該數(shù)值落在文獻報道的開闊大洋水體反硝化速率范圍［0.000 24～2.7μmol/（dm3·d）］之內(nèi)［24，28］。

圖4 KJ12站（a）和KJ63站（b）氧極小值層水樣29 N2濃度隨培養(yǎng)時間的變化

4 結(jié)論

（1）利用15N示蹤法測量海水反硝化速率的過程中，樣品長時間的存放有可能會受到空氣擴散進入的影響，由此導致29N2濃度的分析結(jié)果異常，進而影響反硝化速率的準確定量。

（2）由于空氣中29N2/28N2比值恒定為0.007 35，并且在空氣擴散進入培養(yǎng)體系的過程中該比值幾乎不會發(fā)生變化，故提出利用該恒定的比值，通過質(zhì)量平衡方程校正空氣29N2背景的影響，在培養(yǎng)體系只存在反硝化作用的情況下，將樣品實測的29N2濃度扣除由外界空氣貢獻的29N2濃度，就可得到由生物反硝化作用產(chǎn)生的29N2準確值，進而可獲得準確的反硝化速率。

（3）對南海實際海水樣品的研究表明，經(jīng)空氣29N2背景校正后，培養(yǎng)體系29N2濃度與培養(yǎng)時間之間的線性關(guān)系顯著加強，由此計算出的反硝化速率更為可靠。

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