慕 勇，胡建宏

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

精液保存技術(shù)自發(fā)明以來，成為提高優(yōu)良種畜利用率、加速育種進程最有效的手段之一，為畜牧業(yè)發(fā)展做出巨大貢獻。精液的保存方法分為冷凍保存和液態(tài)保存，冷凍保存以實現(xiàn)長期保存，擴大橫式的地域種質(zhì)交流和縱式的品種資源保存。液態(tài)保存時間較短，分為常溫保存（15～25 ℃）和低溫液態(tài)保存（0～5 ℃），用以擴大精液量，提高種畜利用率。目前，除了在牛精液冷凍保存技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而其他物種（豬、羊、禽等）的精液冷凍保存效果不盡理想。近年來人們將人工授精的工作重點放在液態(tài)精液的應(yīng)用上，特別是豬、馬、兔、羊等家畜冷凍精液尚難在生產(chǎn)上推廣的現(xiàn)狀下，液態(tài)保存精液有很大的應(yīng)用前景。在精液液態(tài)保存過程中，人們采用諸多方法如降低能量消耗、抑制精子代謝活動、保護精子線粒體等以達到延長精液保存時間而保持較好受精能力的目的。山羊精液液態(tài)保存的適宜溫度為2～15 ℃，一般為4～5 ℃最優(yōu)。迄今為止已有很多稀釋液用于山羊精液的液態(tài)保存，如檸檬酸鈉－卵黃，蔗糖－乙二胺四乙酸（EDTA），檸檬酸鈉－果糖－卵黃等。但保存效果都不太理想，保存時間一般在5～72h。國內(nèi)外關(guān)于液態(tài)保存山羊精液的研究很多，然而稀釋液成分大多比較復(fù)雜、繁多，保存效果也并不十分理想，降低了優(yōu)良種公羊利用率，增加養(yǎng)殖成本。本文針對羊精液低溫保存稀釋液的成分及其作用、精液的稀釋倍數(shù)等進行綜述，旨在為山羊精液的低溫保存研究提供一定的參考。

1 精液低溫保存技術(shù)

精液的低溫保存是指將稀釋處理好的精液在0～5 ℃條件下保存。其原理是通過降低溫度，使精子代謝活動減弱，當(dāng)溫度降至0～5 ℃時，精子代謝較弱，幾乎處于休眠狀態(tài)，此時精子的物質(zhì)代謝和能量代謝水平降到最低，廢物積累減少。而且低溫保存條件還能有效抑制有害微生物的生長，有利于精子生存，從而延長精子的存活時間。低溫保存的精液，當(dāng)溫度回升后，能恢復(fù)正常代謝機能而不喪失受精能力。精液在稀釋過程中精液的成分發(fā)生改變會引起精子理化性質(zhì)的變化，甚至有可能對精子帶來致命打擊，精液溫度降低時精子也會因受到冷打擊而造成精子冷休克。因此好的的保存稀釋液是人工授精技術(shù)得以順利實施的關(guān)鍵。合理的選擇稀釋液成份以及正確的稀釋方法和稀釋倍數(shù)是保障低溫保存效果優(yōu)良的技術(shù)關(guān)鍵。

2 稀釋液的主要成分和生理作用

稀釋液作為精子的生活環(huán)境，其目的是抑制精子代謝活動，降低能量消耗，從而延長精子保存時間而不使其喪失受精能力。在低溫條件下，稀釋液的主要作用就是為精子提供能量，優(yōu)化精子所處環(huán)境的滲透壓及pH，防止精子細胞內(nèi)磷脂的流失并起到抗冷休克的作用，去除高度稀釋對精子的負面影響，防止細菌污染，給精子適應(yīng)外界環(huán)境創(chuàng)造有利條件。因此，良好的稀釋液應(yīng)具備以下功能：提供精子運動所需能量；抵抗冷休克；緩沖pH 變化；平衡滲透壓和電解質(zhì)；抑菌殺菌；擴大精液量。

2.1 糖類

精子的存活和維持運動需要消耗能量，糖類作為能源物質(zhì)，可為精子提供營養(yǎng)，補充精子能量。大量研究證明，精子不能直接利用外界營養(yǎng)物質(zhì)，而主要靠分解精子細胞內(nèi)部的物質(zhì)來獲取能量。小分子糖類（如葡萄糖、果糖）能穿過精子質(zhì)膜為精子代謝提供能量，而大分子糖類（如蔗糖、海藻糖和葡聚糖）不能穿過精子質(zhì)膜，但能調(diào)節(jié)滲透壓，維持質(zhì)膜穩(wěn)定性，以利于精子的存活［1］。稀釋液中常用葡萄糖和果糖為精子補充能量，趙本田等［2］認為山羊精液保存時以只含葡萄糖時保存效果最好。徐振軍等［3］對絨山羊精液低溫保存研究中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加蔗糖和乳糖對維持精子活力和保護精子頂體并沒有顯著效果，認為該兩種糖的添加使稀釋液粘稠度增加，降低了精子的活力。Salamon等［4］研究認為，在液態(tài)保存中，蔗糖等二糖并不為精子提供能量，只是起到在維持胞外滲透壓、保護質(zhì)膜的作用。

2.2 緩沖物質(zhì)

正常情況下，山羊精液呈弱酸性或中性，pH 為6.8～7.0 之間。為防止稀釋過程及稀釋后使精液pH 發(fā)生巨變，稀釋液中需添加緩沖劑來維持酸堿度的相對穩(wěn)定，維持精子生存環(huán)境的相對穩(wěn)定，防止精子因過酸而死亡。稀釋液中可用的緩沖劑有檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、HEPES（4－羥乙基哌嗪乙磺酸）等。其中Tris的緩沖效果最好，Tris不僅有良好的緩沖性，而且高濃度對精子的毒性也很低［5］。HCO3－過量可能使精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變誘發(fā)獲能［6］，HEPES 等兩性有機物可以鏊合部分有害金屬離子，緩沖能力較其他緩沖劑強且不受溫度影響［7］。Newth 等［8］認為現(xiàn)配稀釋液pH 在60～90min內(nèi)不穩(wěn)定，隨時間變化，不同稀釋液的pH 變化規(guī)律相異。

2.3 卵黃

生存環(huán)境溫度的降低會使精子受到冷打擊而休克，失去受精能力。卵黃被用作常規(guī)保護劑廣泛應(yīng)用于各種動物的精液稀釋，低溫保存時向稀釋液添加卵黃可以對精子提供熱保護，而茆達干等［9］認為添加卵黃會使波爾山羊精液保存時間縮短，卵黃對羊精子有一定的副作用。卵黃作為動物源性的添加劑，必然不可避免微生物的污染，另外山羊精清中含有卵黃凝集因子，與卵黃產(chǎn)生凝集作用。因此在山羊精液保存中應(yīng)合理添加卵黃，大量研究顯示將卵黃濃度從20%下降至5%不會影響受胎率，而進一步降低卵黃濃度，受胎率將會下降［10］。卵黃中為精子提供保護的主要物質(zhì)是卵磷脂（PC），PC 熔點低，低溫不易凍結(jié)，保護精子生存，還有改善細胞脂類代謝，提高細胞抗氧化能量等多重優(yōu)點。胡傳水等［11］用大豆卵磷脂代替卵黃后保存豬精液，結(jié)果表明以1.5%卵磷脂效果最佳。奶類也是常用低溫保護劑，研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精液液態(tài)2～5 ℃保存條件下，脫脂乳的效果優(yōu)于全乳，若在脫脂乳類稀釋液中添加1%的葡萄糖和5%的卵黃可提高精子活力，而脫脂乳保存的精液要保證好的受胎率則須在8～10h內(nèi)輸完精［12］。

2.4 抗生素

一般情況下，新鮮精液基本無菌，但在稀釋過程中無可避免的會引入一些雜菌，細菌的污染會造成精子凝集、頂體破壞、pH 下降等一系列不利影響。添加適量抗生素可改善精液保存效果，提高受胎率。傳統(tǒng)的稀釋液以使用青霉素為主流，后來研究認為青霉素與鏈霉素聯(lián)合使用效果更佳。另有研究指出，精液保存時可能造成影響的細菌種類繁多以大腸桿菌危害最甚，其能使精子短時間內(nèi)失活，還會破壞頂體質(zhì)膜［13］，而青、鏈霉素對革蘭氏陽性菌抑殺效果顯著，對大腸桿菌卻沒有效果。吳結(jié)革等［14］研究證實，用恩諾沙星保存精液的效果確實比使用青、鏈霉素等效果好，其適宜使用量為50μg／mL。

2.5 抗氧化物

抗氧化劑在精液保存中發(fā)揮的作用越來越引起人們關(guān)注。精子區(qū)別于其他細胞，胞內(nèi)缺乏抗氧化物質(zhì)，精子質(zhì)膜中又沒有足夠的脂肪酸類物質(zhì)，致使精子易受氧化損傷，精液稀釋保存操作過程中，有氧和可見光環(huán)境加速氧化作用，精子活力和質(zhì)膜完整率受到影響，此時添加抗氧化物可以有效克制這種損傷［15］。在稀釋液中添加褪黑激素（MLT）和超氧化物歧化酶（SOD），能夠延長精子存活時間，過氧化氫酶（CAT）提高山羊精子膜完整率和頂體完整率［16］。孫琪［17］研究表明，在稀釋液中添加適量的谷胱甘肽（GSH）、褪黑激素（MLT）、丁羥甲苯（BHT）均能提高豬精液的保存效果。

2.6 其他成分

血清蛋白（BSA）是一種蛋白類保護劑，能有效地延長精液保存時間，提高保存后精子的受精能力。Matsuoka等［18］研究羊精液冷凍保存表明，用10%～15%的BSA 能起到跟卵黃相當(dāng)?shù)谋Ｗo作用。趙本田等［2］研究認為，含5% PVA（聚乙烯醇）的稀釋液有利于精液保存，PVA 的烯醇式結(jié)構(gòu)與水分子氫形成氫鍵，改變液體表面張力，利于平衡精子質(zhì)膜內(nèi)外的作用力。Ca2＋內(nèi)流能引起頂體反應(yīng)，啟動精子獲能，不利于保存，故配制稀釋液應(yīng)使用去離子水，同時也可添加適量EDTA 等螯合劑減少稀釋液中的有害金屬離子［19］。陳宗明等［20］研究了維生素C對貴州黑山羊低溫保存精液品質(zhì)的影響，添加維生素C 3.0mg／mL 時，可以顯著提高貴州黑山羊的精液品質(zhì)，張培松等［21］用維生素B12稀釋小尾寒羊精液，5～10 ℃下保存，發(fā)現(xiàn)維生素B12能顯著提高精子的有效存活時間，精子有效存活時間（活力高于0.6）和最長存活時間（90%精子死亡時間）特別是以1∶3比例稀釋時可以分別達到22h 和49h 而不含維生素B12的稀釋液有效存活時間和最長存活時間僅為7h 和17h。

3 精液稀釋倍數(shù)

精液稀釋時使小分子蛋白、自然抗氧化劑、脂肪酸類物質(zhì)等重要成分的濃度降低，導(dǎo)致精子聚集、結(jié)構(gòu)受損，縮短精液保存時間，高倍稀釋后對精子的存活時間、受精能力都有不良影響［22］。但稀釋精液能使其中抑制精子獲能的物質(zhì)濃度降低，有利于精子獲能。王柏山等［23］研究表明，稀釋倍數(shù)在10 倍以下，可以獲得比較高的受胎率，7、10倍稀釋與原精液受胎率差異都不顯著，15倍稀釋與原精液受胎率差異極顯著，一次輸入有效精子數(shù)30×106個以上受胎效果好。李助南等［24］研究表明，山羊精液稀釋倍數(shù)應(yīng)以2～5倍為宜；徐振軍等［25］采取6～8倍稀釋，并未出現(xiàn)不良影響；劉福元等研究報導(dǎo)精液保存以8倍稀釋為佳［26］。

4 存在問題與展望

山羊的繁殖具有明顯的季節(jié)性，如果生產(chǎn)中不使用激素進行同期發(fā)情處理，則羊的發(fā)情不集中，繁殖周期拉長，采集羊精液麻煩，使用液態(tài)精液保存是克服這一矛盾最便捷的辦法。用液態(tài)低溫保存精液，由于保存簡單，技術(shù)容易掌握，因而其具有廣闊的應(yīng)用前景。

山羊精液低溫保存技術(shù)雖然已進入應(yīng)用階段，然而保存稀釋液的配方不盡完美，保存方法不夠完善，精液在保存過程中其活力和受精能力受到諸多因素的影響，如氧化損傷、代謝酸化、DNA 斷裂、精子質(zhì)膜蛋白和脂類組分發(fā)生變化、頂體反應(yīng)以及自發(fā)獲能等，導(dǎo)致精液的保存時間短，人工授精受胎率低，該技術(shù)的優(yōu)勢未能得到長足的發(fā)揮，極大程度的限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，深入研究羊精液保存技術(shù)，開發(fā)新型稀釋液配方，減少精液保存過程對精子的損傷，以構(gòu)建更適宜精液體外生活的環(huán)境。

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