張占龍,宋永鴻,李 敏,李梅霞

(1.青海省化隆縣畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省動物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810003；3.青海省貴南縣過馬營鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 貴南 813101)

我國豬瘟疫苗效力檢驗的替代方法研究與應(yīng)用進展

張占龍1,宋永鴻2,李 敏3,李梅霞2

(1.青海省化隆縣畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省動物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810003；3.青海省貴南縣過馬營鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 貴南 813101)

我國獸藥典中現(xiàn)行的豬瘟疫苗效力檢驗方法存在試驗成本較高、周期較長、操作較繁瑣、重復(fù)性較差、敏感性較低等缺點，隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的日臻發(fā)展與應(yīng)用，豬瘟疫苗效力檢驗的新興替代檢驗方法不斷發(fā)展和完善。論文就我國近年來針對豬瘟疫苗毒種、半成品、成品效力檢驗的新興分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測方法的研究與應(yīng)用進展做一簡要綜述，旨在為提升我國豬瘟疫苗效力檢驗水平提供合理的科學(xué)依據(jù)。

豬瘟疫苗；效力檢驗；替代方法；研究與應(yīng)用

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病。豬瘟在世界范圍內(nèi)流行，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]，該病被世界動物衛(wèi)生組織列為A類烈性傳染病，被我國農(nóng)業(yè)部列為一類動物疫病，是目前阻礙著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展的首要動物疫病[3-4]。我國采用豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)強制免疫接種為主要防治措施，使豬瘟在我國得到了有效控制，豬瘟頻發(fā)的大流行狀況已得到根除[5]，但近年來，我國豬瘟疫苗免疫失敗的病例逐漸增多，周期性、波浪式的地區(qū)散發(fā)性流行日益嚴(yán)重[6]。導(dǎo)致疫苗免疫失敗的原因很復(fù)雜，除了免疫程序不合理、母源抗體的干擾等原因外,疫苗效力達不到要求是其中一個重要原因[7]。由于豬瘟病毒不易產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此獸藥典中對其抗原病毒含量或疫苗效力檢驗主要依靠家兔或豬進行動物試驗[8]，因用豬進行檢驗成本太高、試驗操作難度太大、周期太長，故在生產(chǎn)實際中多采用兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法仍然存在試驗周期較長、操作較繁瑣、重復(fù)性較差、敏感性較低等缺點，且受試驗動物的個體差異、環(huán)境因素等多方面原因影響，檢測結(jié)果不是十分準(zhǔn)確。隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的日臻發(fā)展與應(yīng)用，豬瘟疫苗效力檢驗的新興替代檢驗方法不斷發(fā)展和完善。本文就我國近年來針對豬瘟疫苗毒種、半成品的效價檢驗和成品疫苗效力檢驗的新興分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測方法的研究與應(yīng)用進展做一簡要綜述，為提升我國豬瘟疫苗效力檢驗水平提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 qRT-PCR方法

qRT-PCR方法可以對豬瘟病毒核酸含量進行準(zhǔn)確定量，與兔體定型熱反應(yīng)方法相比，具有快速、敏感、高通量和實時等優(yōu)點，為豬瘟疫苗毒種、半成品、成品中病毒含量的測定提供了新的技術(shù)方法。Lin等[9]應(yīng)用qRT-PCR方法對豬瘟培養(yǎng)細(xì)胞中的病毒含量進行實時監(jiān)測，qRT-PCR方法較免疫熒光方法具有更高的敏感性，且檢測快速、定量準(zhǔn)確，可以將其用于豬瘟毒種與半成品的生產(chǎn)中確定最佳收毒時間，從而提高豬瘟疫苗質(zhì)量。陳鍇等[10]建立的定量檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒核酸含量的qRT-PCR方法僅能擴增豬瘟兔化弱毒疫苗株，最低可檢測到4.35個cDNA拷貝量，該方法與兔體定型熱反應(yīng)同時對4個廠家17個批次的34份豬瘟疫苗進行效力檢驗，二者表現(xiàn)出了良好的相關(guān)性。葛葉等[11]采用qRT-PCR方法與兔體定型熱反應(yīng)對5份豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗成品和6份半成品樣品進行平行檢測，結(jié)果表明qRT-PCR方法檢測結(jié)果中最低105個病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，最低103個病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生輕熱反應(yīng)，qRT-PCR方法的檢測過程僅需3.5 h，大大縮短了豬瘟疫苗的檢測時間，可以補充傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)用于豬瘟兔化弱毒疫苗半成品與成品的檢驗。韓文等[12]利用qRT-PCR方法對278批次豬瘟疫苗進行效力檢驗，有66批次(24 %)疫苗病毒含量達不到獸藥典要求標(biāo)準(zhǔn)，抽取其中6份采用兔體定型熱試驗進行驗證，兩種檢驗方法的結(jié)果完全一致，表明qRT-PCR方法可以作為評價豬瘟疫苗質(zhì)量的一種替代方法?？傊?，qRT-PCR檢測方法可以替代傳統(tǒng)的兔體定型熱試驗用于疫苗生產(chǎn)過程中的毒種、半成品的病毒含量測定，進而指導(dǎo)疫苗的配制，也可以用于豬瘟成品疫苗的效力檢驗，可成為實驗室和豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)等進行豬瘟疫苗效力檢驗的敏感、準(zhǔn)確和快速的替代檢驗方法。

2 RT-LAMP方法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)方法操作簡單、無需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，特別適合基層實驗室應(yīng)用。Zhang等[13]根據(jù)CSFV NS5B 基因序列，利用在線軟件Primer Explorer V4設(shè)計了針對CSFV兔化弱毒疫苗株的一套RT-LAMP引物，建立了可視化檢測豬瘟兔化弱毒疫苗株的RT-LAMP方法，該方法65 ℃恒溫反應(yīng)1 h 即可完成擴增過程，檢測CSFV-強毒株、BVDV、PRRSV、PRV、TGEV、PPV、PEDV、PCV-2、PrV均為陰性，檢測靈敏度與qRT-PCR方法相當(dāng)，均達到5個拷貝，應(yīng)用RT-LAMP 方法和qRT-PCR方法對15個廠家生產(chǎn)的39個批次的58份市售豬瘟活疫苗的病毒核酸進行了檢測分析，58份疫苗中有46份經(jīng)兩種方法檢測均為陽性，二者的符合率達100 %。RT-LAMP方法快速、簡單、靈敏、無需特殊儀器設(shè)備，但該方法只能根據(jù)檢測結(jié)果的渾濁度進行病毒含量的定性檢測，以及陰性、弱陽性、中陽性和強陽性的半定量檢測，還無法實現(xiàn)qRT-PCR方法對病毒含量的實時定量跟蹤檢測，故其適合用于試驗條件一般的基層實驗室。

3 ELISA方法

ELISA方法即可用于測定抗原，也可用于測定抗體，具有靈敏、特異、快速、高通量及易于操作等優(yōu)點，在豬瘟抗原病毒含量的測定和豬瘟抗體效價的測定中得到了廣泛開發(fā)應(yīng)用。在抗原定量檢測方面，唐紅慧等[14]應(yīng)用進口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒對已做過兔體定型熱反應(yīng)和qRT-PCR檢測的8個批次豬瘟成品細(xì)胞苗和13個批次豬瘟成品脾淋苗進行抽檢測定其抗原含量，ELISA方法可檢出20頭份/瓶(或者109個病毒拷貝數(shù)/瓶)及以上的成品疫苗；該試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)測定4個批次24份HCLV半成品細(xì)胞苗的抗原含量，二種方法的符合率高達95.8 %，但該方法無法區(qū)分豬瘟病毒抗原與牛流行性腹瀉病毒抗原。肖鋒等[15]研究也表明進口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒能夠穩(wěn)定、快速、簡單地用于CSFV病毒含量測定。豬瘟ELISA抗原定量檢測方法能夠穩(wěn)定、快速、簡單地用于豬瘟細(xì)胞苗的半成品與成品的病毒含量測定，幫助篩選疫苗生產(chǎn)過程中不同滴度的病毒液，確定最佳收毒時間和階段，為豬瘟疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了一種準(zhǔn)確和穩(wěn)定的定量檢測方法。在抗體效價測定方面，李嬌等[16]建立了豬瘟抗體的PPA-ELISA檢測方法，該方法以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)為二抗，SPA能與豬、兔等哺乳動物血清IgG的Fc段結(jié)合，使該方法可應(yīng)用豬瘟疫苗免疫后的豬、兔血清抗體效價檢測。蔣卉等[17]采用IDEXX商品化的豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)進行豬瘟疫苗效力檢驗，兔體定型熱反應(yīng)與ELISA抗體檢測結(jié)果具有較高的正相關(guān)性，兩者符合率達95.83%。雖然ELISA抗體檢測方法依然采用家兔進行效力檢驗，但省去了兔體定型熱反應(yīng)方法中每6 h進行1次家兔測溫工作的繁瑣操作，且可以有效地排除體溫檢測中輕熱反應(yīng)和可疑反應(yīng)帶來的不確定性，從而提高檢驗工作的效率和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 IFA方法

間接免疫熒光(Indirect Immunofluorescence Assay，IFA)方法是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異性抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法，在熒光顯微鏡下，熒光素受激發(fā)光的照射可發(fā)出明亮的熒光，從而完成對抗原的定位以及抗原含量的定量。李晶梅等[18]使用韓國JBT公司豬瘟單抗作為一抗，熒光素標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，建立了檢測豬瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)的IFA方法，并與兔體反應(yīng)熱法進行了比較，證明兩者存在一定平行關(guān)系，但IFA方法比兔體反應(yīng)熱法檢測結(jié)果的數(shù)值低1個數(shù)量級左右，IFA方法與兔體定型熱反應(yīng)之間的正向關(guān)系使IFA成為豬瘟疫苗效力檢驗的替代方法成為可能。隨后，戴志紅等[19]以豬瘟病毒抗體(兔源)為一抗、熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，建立了定量檢測CSFV兔化弱毒株的IFA方法，該方法檢測CSFV兔化弱毒株接種的PK細(xì)胞為陽性，而檢測PRV、PPV、BVDV接種的PK細(xì)胞均為陰性，并探索得到了IFA方法測定的TCID50與兔體定型熱反應(yīng)測定的家兔體感染量(RID)之間的數(shù)量關(guān)系公式：1 RID/mL=(TCID50/0.1 mL+200)/12，IFA方法可作為豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗的體外替代檢驗方法。IFA方法與兔體定型熱反應(yīng)方法相比，具有快速、特異、穩(wěn)定等優(yōu)點，但該方法仍需要采用細(xì)胞培養(yǎng)病毒，與ELISA方法相比，試驗難度較高，操作較復(fù)雜，檢驗耗時較長。

5 膠體金檢測方法

膠體金檢測技術(shù)是一種新興的免疫檢測技術(shù)，具有方便快速、操作簡單、靈敏度高、特異性強、無需特殊儀器等優(yōu)點，同ELISA方法一樣可用于測定豬瘟抗原病毒含量和豬瘟抗體效價。楊明等[20]、李華瑋等[21]先后建立了檢測豬瘟病毒抗原和豬瘟抗體的膠體金試紙條，將待測樣品加入試紙條的加樣孔內(nèi)，20 min內(nèi)就可以檢測出是否帶有豬瘟抗原或豬瘟抗體，同時還可以根據(jù)試紙條的顏色深淺將檢測結(jié)果分為陰性、弱陽性、中陽性和強陽性，從而判定豬瘟抗原病毒含量的多少或豬瘟抗體效價的高低，但目前膠體金檢測方法僅能夠進行定性和半定量檢測，還無法達到qRT-PCR方法和ELISA方法的定量監(jiān)測分析，且膠體金檢測技術(shù)只停留在了對臨床病料中豬瘟抗原和抗體的檢測，還未見將其應(yīng)用于豬瘟疫苗效力檢驗中的報道，隨著膠體金檢測技術(shù)不斷開發(fā)與應(yīng)用，其在豬瘟疫苗效力檢驗中將會有廣闊的應(yīng)用價值。

6 結(jié) 語

我國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)的安全性和免疫效力毋庸置疑，但在臨床生產(chǎn)應(yīng)用中的豬瘟弱毒疫苗有的不是正規(guī)廠家生產(chǎn)的，有的未經(jīng)過嚴(yán)格檢驗，有的達不到規(guī)定效價，造成了臨床中的免疫失敗。加強豬瘟疫苗的質(zhì)量控制是豬瘟綜合防控的重要步驟，而快速準(zhǔn)確的檢測豬瘟毒種、半成品、成品疫苗中的病毒含量是生產(chǎn)合格疫苗的有效保證。在豬瘟疫苗效力檢驗的這些分子生物學(xué)與免疫學(xué)新興替代檢驗方法中qRT-PCR方法和ELISA方法定量準(zhǔn)確，是豬瘟疫苗效力檢驗的首選替代方法，但qRT-PCR方法對儀器設(shè)備和操作人員要求均較高，基層實驗室和一般豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)由于不具備試驗條件很難展開；ELISA方法操作簡單、檢測快速，且高通量，非常適合大批量樣品的檢測，適合一般實驗室應(yīng)用，將具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景；IFA方法需要進行細(xì)胞培養(yǎng),操作較繁瑣，且不能準(zhǔn)確定量，在應(yīng)用上受到一定的限制；RT-LAMP和膠體金方法均無需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，操作簡單、檢測快速，特別適合基層獸醫(yī)實驗室應(yīng)用，但這2種檢測方法目前只能實現(xiàn)定性和半定量檢測。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的進一步開發(fā)與應(yīng)用，我國豬瘟疫苗的這些效力檢驗方法必將會不斷發(fā)展和完善，逐步上升為國家法定標(biāo)準(zhǔn)，從而全面提高我國豬瘟疫苗效力檢驗水平，保障我國豬瘟疫苗質(zhì)量。

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ProgressinResearchandApplicationofAlternativeMethodsforEffectiveTestofClassicalSwineFeverVaccineinChina

ZHANG Zhan-Long1,SONG Yong-Hong2,LI Ming3,LI Mei-Xia2

(1.HualongCountyBureauofAnimalHusbandry,Hualong,Qinghai810900,China;2.QinghaiProvincialAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Xining,Qinghai810003,China;3.GuomaTownshipAnimalHusbandryandVeterinaryStation,Guinan,Qinghai813101,China)

The current swine fever vaccine efficacy test methods in China's Veterinary Pharmacopoeia have the disadvantages of high cost,long cycling period,complex operation,poor repetition,and low sensitivity.With the application of molecular biology and immunology technology,the alternative test methods for classical swine fever vaccine potency test have undergone continuous development and improvement.This paper briefly reviewed the progress in research and application of classical swine fever vaccine,semi-finished products,new molecular biological and immunological detection methods for testing the effectiveness of the product in China in recent years,aiming to provide a reasonable scientific basis for enhancing the classical swine fever vaccine potency test level in China.

classical swine fever vaccine; efficacy test; alternative methods; research and application

2014-04-17，

2014-05-01

張占龍(1978-)，青?；∪耍究?，研究方向：疾病預(yù)防和控制。E-mail:zhangzhanlong1978@qq.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0086-04