李朝政,許佳明,王 燁,呂昌亮,張海婷,段 青,黃曉巍*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117;2.中國中醫(yī)科學(xué)院,北京 100700)

心臟疾病的發(fā)生多數(shù)伴有心肌細(xì)胞損傷，而維持心肌細(xì)胞數(shù)目是心肌損傷修復(fù)的關(guān)鍵，體內(nèi)自身的潛能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化可能是實現(xiàn)受損心肌組織靶向修復(fù)的重要途徑。心肌干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是最具心肌分化潛能的干細(xì)胞。心肌損傷時，這些干細(xì)胞可以被激活，并迅速向損傷處遷移，分化為成熟的心肌細(xì)胞，通過靶向修復(fù)增加心肌細(xì)胞的數(shù)量。鹿茸多肽是從新鮮鹿茸中提取的一類多肽類物質(zhì)，具較強(qiáng)的生物活性，鹿茸多肽對骨組織、神經(jīng)纖維損傷的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。對損傷后期心肌修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能通過誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞參與心肌損傷的靶向修復(fù)。為此，本研究針對體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法觀察鹿茸多肽對誘導(dǎo)前后心肌細(xì)胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重鏈(β-MHC)的表達(dá)的影響，探討鹿茸多肽對心肌干細(xì)胞分化的促進(jìn)作用及機(jī)制。

1 實驗材料

新生SD大鼠，清潔級，由吉林大學(xué)動物實驗研究中心提供。鹿茸多肽，長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心提供。Trizol試劑(美國Life Technologics)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)公司)，PCR引物(上海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(瑞士Fluka公司),膠原酶Ⅱ(美國sigma公司)，胎牛血清。

DL-2000 Marker(日本Takara生物工程公司),GeneAmp PCR System 2700(日本Takara生物工程公司)，Biofuge primo R低溫離心機(jī)(德國Heraeus公司)，WD-9403C紫外分析儀(北京市六一儀器廠)，VDS凝膠成像系統(tǒng)(瑞典Pharmacia公司)，胎牛血清(瑞士Fluka公司)。

2 實驗方法

2.1 大鼠心肌干細(xì)胞分離和生物學(xué)特性鑒定[1]

2.1.1 心肌干細(xì)胞的獲取 取出生后第2天的新生鼠，斷頸后置于75%的乙醇內(nèi)消毒30 s,在無菌條件下取整個心臟置于直徑為3.5 cm培養(yǎng)皿中剪成大約1 mm3的小塊狀心肌組織，用不含鈣磷的PBS液沖洗心肌組織碎塊至液體澄清。然后加入0.25%胰酶2 mL消化5 min后吸出消化液，加入0.1% Ⅱ型膠原酶2 mL，消化5 min，棄去消化液。上述交替消化過程重復(fù)3次后，向心肌組織碎塊加入完全培養(yǎng)液,洗2次后，將心肌組織碎塊移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，盡量在瓶底均勻鋪開，上述操作均在25 ℃室溫下完成。然后加入少量CEM培養(yǎng)液約1 mL，放入37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入4 mL CEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，為原代培養(yǎng)。1個心臟所得到的組織碎塊種植于1個培養(yǎng)瓶中。每3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長情況。

2.1.2 心肌干細(xì)胞的傳代 10 d左右細(xì)胞增殖鋪滿培養(yǎng)瓶底,即可進(jìn)行傳代。吸取并棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用PBS液洗2次，加入0.25%胰酶1 mL消化2～3 min，鏡下可見細(xì)胞收縮變圓，立即加入10 mL CEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，并反復(fù)用吸管吸取瓶底液體吹打培養(yǎng)瓶底壁，使附壁細(xì)胞脫落形成細(xì)胞液，將細(xì)胞液移至15 mL離心管,1 000 r/min離心5 min。棄去上清并重新加入CEM培養(yǎng)液10 mL，按1∶2傳代的比例分成2個培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞3 d換液1次。

2.1.3 流式細(xì)胞儀鑒定 取P0代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞液加入2 μL CD特異性檢測用單克隆抗體冰上孵育30 min，用PBS/Azide液1 mL洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，共用PBS液洗2次。然后加入100 μL PBS/Azide液及100 μL 2%多聚甲醛，搖勻后立即送流式細(xì)胞儀檢測。

2.1.4 細(xì)胞形態(tài) 心肌組織碎塊植入培養(yǎng)瓶后,2～3 d后可見有細(xì)胞自心肌組織碎塊的邊緣移出，并沿著組織碎塊的周圍呈同心圓向外圍生長。原代及P1代細(xì)胞常有雜質(zhì)細(xì)胞，其形狀及大小與心肌干細(xì)胞明顯不同，但經(jīng)過傳代至P3及P4代時，這些細(xì)胞就會死亡和消失，得到的是較純的CSCs。P1代細(xì)胞及之后的傳代細(xì)胞的生長類似于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的同心圓狀生長。在用CEM不斷傳代的過程中，未見有干細(xì)胞向搏動的心肌細(xì)胞的分化,一直保持干細(xì)胞旺盛的分裂和增殖的特征。鑒定心肌干細(xì)胞所采用的主要方法是通過流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志。選取了c-kit，CD29，CD90，CD34，CD45對所培養(yǎng)出來的P0代心肌干細(xì)胞的特征進(jìn)行了流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示這些CSCs其c-kit，CD29，CD90為陽性，CD44，CD45為陰性。

2.2 鹿茸多肽誘導(dǎo)及條件培養(yǎng)基制備 將P3代CSCs用胰酶消化后，制成細(xì)胞懸液,用CEM培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為105/mL，分別接種到50 mL塑料培養(yǎng)瓶中和孔內(nèi)放有載玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，共接種7瓶和2塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞貼壁后，加不同濃度(50,100,200,400,800,1 600 μg/mL)鹿茸多肽進(jìn)行體外誘導(dǎo)實驗。每隔2～3 d換1次培養(yǎng)液，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。其中6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種的細(xì)胞用于免疫組化染色,另外7瓶用于RT-PCR分析。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，用細(xì)胞刷收集用于RT-PCR分析的細(xì)胞，液氮中保存?zhèn)溆?；用鑷子取出用于免疫組化染色瓶內(nèi)的載玻片，用各種抗體進(jìn)行免疫組化染色。

2.3 RT-PCR分析鹿茸多肽對HMC基因表達(dá)影響 將RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平。

2.3.1 PCR引物序列 β-MHC，sense:5’-caagggcctgtgctacta-3’，antisense:5’-gaccgtgtccagctcg-3’，擴(kuò)增片段大小196bp。α-MHC，sense:5’-ccggagtattgggaggag-3’，antisense:5’-ggatggtgtgagagcgg-3’，擴(kuò)增片段大小118bp。GAPDH1，sense:5’-gttaccagggctgccttc -3’，antisense:5’-gatgaccagcttcccatt-3’，擴(kuò)增片段大小156bp。GAPDH 2，sense:5’-gttaccagggctgccttc -3’，antisense:5’-cccttcaggtgagcccca-3’,擴(kuò)增片段大小290 bp。以上引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。1)按引物合成單上所給引物的量，將所有引物均稀釋成10 pmol/L后,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?)75%乙醇：量取無水乙醇75 mL，加DEPC處理過的水25 mL，混合后使用。3)PBS：在800 mL蒸餾水中溶解8 g NaCl、0.2 g KCl和3 g Tris堿，加入0.015 g酚并用HCl調(diào)至pH值至7.4,用蒸餾水定容至1 L，分裝后在121磅高壓下蒸汽滅菌20 min，于室溫保存。4)TBE:pH8.5，0.08 mol/L Tris-HCl；0.08 mol/L硼酸；0.002 4 mol/L EDTA。5)上樣緩沖液:溶解于TBE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料0.025%溴酚藍(lán)、10%甘油即可。6)EB：在100 mL水中加入1 g溴化乙錠，裝入棕色瓶中，室溫保存。

2.3.2 實驗操作過程 按照Trizol試劑盒說明提取腦內(nèi)總RNA。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，具體操作過程如下。1)總RNA制備和鑒定。①取不同濃度誘導(dǎo)的細(xì)胞各1瓶,用細(xì)胞刷收集細(xì)胞于15 mL離心管中，1 500 r/min離心后，將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中。②每管加Trizol試劑1 mL，用無RNA酶玻璃勻漿器將組織勻漿，室溫下放置10 min,按照生產(chǎn)商提供的說明提取組織總RNA。③將組織裂解液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的離心管中,并用吸管反復(fù)吹打直至裂解液中無明顯沉淀,在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。④向上述得到的各組裂解液中各加入氯仿0.3 mL后,振蕩15 s，至粉紅色渾濁液無分層現(xiàn)象，室溫靜置3 min。⑤12，000×g，4 ℃，離心15 min。⑥取出離心管，樣品分為3層：無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相。小心吸取無色上清水相移至另一離心管，水相的體積約為所用Trizol試劑的60%。⑦向上清水相中加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。⑧12,000×g，4 ℃，離心10 min；⑨小心去除上清，緩慢沿管壁加入1 mL 75%的乙醇，輕輕混勻。⑩同上12，000×g，4 ℃，離心10 min；小心吸盡上清，室溫干燥沉淀2～5 min，每管加入50 μL的無RNase水溶解RNA沉淀,待完全溶解后于- 70 ℃保存；吸取RNA 樣品各5 μL，加載到1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色分析提取細(xì)胞總RNA的純度；分別吸取RNA樣品各5 μL用1×TE Buffer稀釋樣品100倍,測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的含量，稀釋成1 μg/μL備用。RNA的濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL。OD260/280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度符合要求。2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按GenAmp RNA PCR試劑盒操作說明，制備的cDNA溶液。具體操作略。3)PCR反應(yīng)。①將上、下游引物用無RNase無菌水稀釋為10p mol/L，按本PCR反應(yīng)體系加入下列溶液到0.2 mL EP管中。②先94 ℃預(yù)變性5 min。③然后94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min。完成35個循環(huán)。④最后72 ℃延伸10 min。3)產(chǎn)物分析。①稱取瓊脂糖粉末0.5 g，加TAE緩沖液50 mL,微波爐加熱使之融化，冷至55 ℃時加入溴化乙錠(EB,5 mg/mL)5 μL至終濃度為0.5 μg/mL，然后將其注入到膠模子中，放好樣品槽梳子，梳齒下端距玻璃板約0.5 mm,待膠凝固后，取出梳子，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1 mm處。②樣品制備與加樣：吸取待測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加6×樣品緩沖液2 μL，混合后，分別加到各上樣孔內(nèi)。③打開電泳儀電源，調(diào)節(jié)電壓為10 V/cm。在低溫條件下電泳30 min。④電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄結(jié)果。4)鹿茸多肽對CSCs細(xì)胞β-MHC和α-MHC基因的表達(dá)檢測分析。利用RT-PCR方法對β-MHC和α-MHC基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析，用GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因。對加不同濃度(50,100,200,400,800,1 600 μg/mL)鹿茸多肽體外誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)細(xì)胞樣本進(jìn)行實驗測定，采用凝膠成像系統(tǒng)對RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果進(jìn)行紫外掃描分析,根據(jù)β-MHC和α-MHC基因與內(nèi)參基因GAPDH的比值大小判斷鹿茸多肽的調(diào)節(jié)作用。

3 實驗結(jié)果

3.1 傳代培養(yǎng)CSCs細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化的比較 心肌細(xì)胞經(jīng)過3代的傳代培養(yǎng),細(xì)胞得到了純化。到第3代，從形態(tài)上判斷心肌干細(xì)胞的純度在95%以上。

3.2 鹿茸多肽對CSCs 分化心肌細(xì)胞特征性基因MHC表達(dá)的影響 實驗結(jié)果表明，鹿茸多肽對CSCs細(xì)胞MHC基因表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用,在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。隨著鹿茸多肽濃度的增加，β-MHC和α-MHC基因的表達(dá)均有所增加。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在受損心肌內(nèi)有大量的處于有絲分裂期的細(xì)胞，這提示心肌細(xì)胞不但能夠自身分裂、再生，而且還有新的細(xì)胞參與，說明心肌本身存在一種自然修復(fù)機(jī)制，并通過相關(guān)機(jī)制實現(xiàn)心肌細(xì)胞的自我更新[2],Kajstura等利用共聚焦顯微鏡檢查對照組成人心臟，發(fā)現(xiàn)約有1.4×107個細(xì)胞在發(fā)生有絲分裂。心肌細(xì)胞更新率在25歲時為1%，在75歲時為0.45%，正常人一生有<50%的心肌細(xì)胞更新過[3-4]?；趯Τ审w干細(xì)胞發(fā)育潛能的重新認(rèn)識，使干細(xì)胞靶向修復(fù)心肌細(xì)胞損傷的研究已成為當(dāng)前心血管病研究領(lǐng)域的熱點。成體心肌干細(xì)胞(CSCs)是成熟機(jī)體的心臟組織中存在的，具有高度自我更新能力和特異性心肌分化潛能的干細(xì)胞，CSCs是目前被認(rèn)為最有希望以完全心肌再生靶向修復(fù)缺血性心肌損傷的干細(xì)胞類型。心肌受到損傷刺激后，CSCs可以在心肌損傷局部激活、并迅速向損傷處遷移，分化為成熟的心肌細(xì)胞，通過靶向修復(fù)增加心肌細(xì)胞的數(shù)量。如何激活自身CSCs，促進(jìn)其在體內(nèi)向心細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等都是亟待解決的問題。到目前為止,5-氮胞苷是誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞的唯一有效化學(xué)制劑，中藥提取成分對心肌干細(xì)胞分化有促進(jìn)作用有報導(dǎo)，廖聯(lián)明等研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對心肌干細(xì)胞分化的促進(jìn)作用[5],中藥淫羊藿的有效成分淫羊藿苷具有誘導(dǎo)分化干細(xì)胞的作用[7]。心肌細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，其收縮蛋白以α-肌球蛋白(α-MHC)為主，主管收縮功能。收縮蛋白包括肌球蛋白,肌動蛋白、向肌球蛋白及向?qū)幍鞍住Ｆ渲屑∏虻鞍装?個重鏈(MHC)、2個輕鏈(MLC),心肌僅有2種MHC基因表達(dá)即α-MHC和β-MHC。因此α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)可認(rèn)為是心肌細(xì)胞特征性基因。干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化時可表達(dá)相關(guān)基因和產(chǎn)生相關(guān)的蛋白作為標(biāo)志，MHC是心肌特異表達(dá)蛋白之一。其表達(dá)水平可以作為實驗觀察指標(biāo),反映干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的情況。

本研究主要通過CSCs的體外培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中加入不同濃度的鹿茸多肽做為生物誘導(dǎo)劑,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法觀察了鹿茸多肽誘導(dǎo)對CSCs細(xì)胞特征性基因α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)的表達(dá)影響，結(jié)果表明，鹿茸多肽對CSCs細(xì)胞MHC基因表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用，在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系,隨著鹿茸多肽濃度的增加，β-MHC和α-MHC基因的表達(dá)均有所增加，提示鹿茸多肽有成為誘導(dǎo)CSCs分化成心肌細(xì)胞生物誘導(dǎo)劑的潛在可能。其相關(guān)研究有待于進(jìn)一步深入。

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