孫萍 唐志琴 穆紅

225例肝病患者自身抗體檢測結果分析

孫萍 唐志琴 穆紅

作者單位：300192 天津市，天津市第一中心醫(yī)院檢驗科

目的 探討各種肝病患者中自身抗體檢測在自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，ALD）包括自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）及原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）中的臨床意義。方法選擇我院2013年1月－2014年2月消化科、肝膽外科、移植外科等收治的各種肝病患者225例，分為ALD患者組和其他肝病患者組。用間接免疫熒光法檢測225份臨床血清標本中抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗平滑肌抗體（antismooth muscle antibody，SMA）和抗線粒體抗體（anti－mitochondrial antibody，AMA），用歐蒙印跡法檢測抗肝腎微粒體抗體（liver kidney microsomal，LKM）、抗肝細胞溶質抗原Ⅰ型抗體（liver cytosol－1，LC－1）、抗可溶性肝抗原抗體／抗肝胰抗體（anti－soluble liver antigen antibody／liver pancreas antigen，SLA／LP）、AMAⅡ型（AMA－M2）并查閱臨床資料，對檢測結果作出分析。結果ALD患者組ANA陽性率為77．78%，SMA陽性率為7．41%，AMA陽性率為55．56%，LKM陽性率為7．41%，AMA－M2陽性率為48．15%，SLA／LP陽性率為7．41%，LC－1陽性率為3．70%。其他肝病患者組ANA陽性率為26．26%，SMA陽性率為4．55%，AMA陽性率為11．11%，LKM陽性率為0．51%，AMA－M2陽性率為5．05%，SLA／LP陽性率為2．53%，LC－1陽性率為1．52%。ALD患者組自身抗體陽性率與其他肝病患者組相比較，ANA、AMA、LKM、AMA－M2差異均有統計學意義（P均＜0．05）。結論ALD患者自身抗體檢出率較高，為臨床醫(yī)生鑒別病毒性肝炎、ALD及其他肝病提供可靠依據。

肝??；自身免疫性肝病；自身抗體

我國最常見的肝病為病毒性肝炎，但也存在相當數量的非病毒性肝病，包括自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease，ALD）、脂肪肝、肝硬化、酒精肝、藥物性肝炎等。ALD通常包括自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH），原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC），上述二種或三種疾病常同時存在進而成為重疊綜合癥［1－3］。而自身抗體檢測對這些疾病的鑒別診斷、診斷具有重要價值［4］。本文研究收集我院肝病患者225例，對其自身抗體進行檢測，并結合臨床做出回顧性分析，探討ALD相關自身抗體的檢測意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇我院2013年1月至2014年2月消化科、肝膽外科、移植外科等收治的肝病患者225例，其中男性109例，女性116例，年齡1～72歲。包括AIH患者15例，PBC患者10例，PSC患者2例，病毒性肝炎患者28例，脂肪肝患者4例，肝硬化患者81例，酒精肝患者6例，藥物性肝炎患者1例，肝占位患者13例，先天性膽道閉鎖患者4例，肝損傷患者61例。

1.2 主要儀器和試劑間接免疫熒光法檢測采用歐蒙（北京）醫(yī)學診斷技術有限公司的馬賽克間接免疫熒光法檢測試劑盒和尼康熒光顯微鏡。歐蒙印跡法檢測儀器為歐蒙（北京）醫(yī)學診斷技術有限公司的印跡法自動操作儀EUROBlotMaster及其提供的配套試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 間接免疫熒光法試劑盒專用于體外檢測人血清或血漿中的抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、抗平滑肌抗體（antismooth muscle antibodies，SMA）和抗線粒體抗體（anti－mitochondrial antibody，AMA）。選擇HEp2、猴肝臟的冰凍切片作為抗原的生物薄片，待檢血清自1∶100起稀釋，與組織細胞孵育30 min；加入異硫氰酸熒光素標記的抗體結合30 min；洗片、封片后熒光顯微鏡觀察結果。組織或細胞內出現特異性綠色熒光、血清稀釋度＞1∶100判斷為陽性。

1.3.2 歐蒙印跡法用于檢測抗肝腎微粒體抗體（liver kidney microsomal，LKM）、抗肝細胞溶質抗原Ⅰ型抗體（liver cytosol－1，LC－1）、抗可溶性肝抗原抗體／抗肝胰抗體（anti－soluble liver antigen antibody／liver pancreas antigen，SLA／LP）、AMAⅡ型（AMA－M2）。將1．5 ml樣本緩沖液放入EUROBlot-Master溫育槽中的實驗反應膜條，溫育5 min，之后吸去溫育槽中液體。在溫育槽中加入1．5 ml已稀釋的血清。于室溫在搖擺搖床上溫育30 min。吸去溫育槽中的液體并在搖擺搖床上用1．5 ml已稀釋的清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5 min。在溫育槽中加入1．5 ml已稀釋的酶結合物（堿性磷酸酶標記的抗人IgG）。于室溫在搖擺搖床上溫育30 min。吸去溫育槽中的液體并在搖擺搖床上用1．5 ml已稀釋的清洗緩沖液清洗膜條3次，每次5 min。在溫育槽中分別加入1．5 ml底物溶液，于室溫在搖擺搖床上溫育10 min。吸去溫育槽中液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次1 min。將完全干燥的膜條黏附于塑料膜上觀察顏色反應，經掃描儀掃描實驗膜條上的條帶結果，直接報告靶抗體陰性或陽性。

1.4 統計學處理使用SPSS 18．0統計學軟件進行統計分析。計數資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALD患者自身抗體陽性率結果ALD患者自身抗體ANA陽性率為77．78%，SMA陽性率為7．41%，AMA陽性率為55．56%，LKM陽性率為7．41%，AMA－M2陽性率為48．15%，SLA／LP陽性率為7．41%，LC－1陽性率為3．70%，見表1。

2.2 其他肝病患者自身抗體陽性率結果198例其他肝病患者自身抗體ANA陽性率為26．26%，SMA陽性率為4．55%，AMA陽性率為11．11%，LKM陽性率為0．51%，AMA－M2陽性率為5．05%，SLA／LP陽性率為2．53%，LC－1陽性率為1．52%，見表2。

2.3 ALD患者組與其他肝病患者組自身抗體陽性率比較ALD患者組自身抗體陽性率與其他肝病患者組相比較，ANA、AMA、LKM、AMA－M2陽性率差異均有統計學意義（P均＜0．05），見表3。

3 討論

ALD是一組由于機體存在自身抗體而引起的肝細胞或肝內外膽管細胞損傷為主要特征的慢性肝病，特點為在肝臟病理性炎癥損傷的同時，血清中存在與肝臟相關的自身抗體。目前認為遺傳易感人群在激發(fā)因素誘導下，自身免疫耐受平衡被打破，機體針對自身抗原做出免疫應答，引起肝臟膽管損傷導致ALD的發(fā)生［5］。自從人們在1965年首次發(fā)現PBC患者血清中存在AMA以來，該自身抗體已成為診斷PBC的主要指標，其中AMA－M2為PBC特異性抗體［6］。抗AMA抗體是以線粒體為靶抗原、無種屬和器官特異性的自身抗體，PBC患者中的抗AMA抗體陽性率高達95%，此項檢測已成為PBC診斷的重要實驗室指標?？笰MA－M2抗體以線粒體內膜上的丙酮酸脫氫酶復合物為靶抗原的抗AMA－M2抗體亞型抗體，是PBC患者高度特異性自身抗體，敏感性為95%～98%，特異性為86%～97%［7，8］。部分PBC患者血清中還存在ANA，其中多核點型和核膜型ANA對PBC患者有較高特異性，可作為AMA陰性患者診斷PBC的指標［8－10］。在本文研究中，PBC患者ANA陽性率為80．00%，AMA、AMA－M2陽性率均為90．00%，這與相關研究［11］結果基本一致，且本文研究中ANA以多核點型為主。在本文研究中抗AMA、AMA－M2抗體的陽性率均為90．00%，較以上報道的結果偏低，究其原因可能與檢測方法的差異及病例數偏少等因素有關，此尚需進行進一步積累、研究。還有10．00%的PBC患者SLA／LP、LC1陽性，這或許與重疊綜合癥有關。有報道［12］顯示，AIH患者自身抗體譜特征主要表現為ANA、SMA、LKM、SLA／LP、LC－1陽性，特別是SLA／LP、LC－1只在AIH組中表現為陽性。本文研究中AIH患者ANA陽性率較高，為80．00%，SMA、LKM陽性率均為13．33%，AMA陽性率為40．00%，AMA－M2陽性率為26．67%，SLA／LP陽性率為6．67%，這與上述報道基本相符，但未檢出LC－1，可能與患者的個體差異有關。在本文研究中，PSC病例數較少，只有2例，其中1例ANA陽性。PSC的診斷還要依據膽管的影像學檢查、肝活檢分為大膽管PSC、小膽管PSC。

表1 ALD患者自身抗體檢測陽性率結果［n（%）］

表2 其他肝病患者自身抗體檢測陽性率結果［n（%）］

表3 ALD患者與其他肝病患者自身抗體檢測陽性結果比較［n（%）］

在本文研究中，肝硬化、肝損害病例數較多，且肝硬化患者、肝損害患者各自身抗體陽性率均較高。之所以肝硬化、肝損害患者自身抗體檢出率較高，是因為肝硬化是一種或者多種致病因素長期反復存在造成肝臟廣泛實質性損害，進而肝細胞彌漫性壞死、結節(jié)狀再生，纖維組織增生，肝臟結構紊亂，質地變硬。由于部分患者早期癥狀不明顯，就診時間較晚，肝硬化、肝損害、肝占位只是其最終的表現形式，形成原因很復雜，其中也包括ALD、慢性病毒性肝炎。另外，在本文研究中，病毒性肝炎ANA陽性率為14．29%。據有關文獻［13］報道在慢性肝炎、肝硬化患者體內存在免疫應答，可引起機體自身免疫紊亂繼而產生自身抗體，與本文研究結果相符。在本文研究中，還出現了酒精肝33．33%的ANA陽性和16．67%的SMA陽性，這可能是因為酒精對肝細胞的毒性通過肝臟的代謝，逐步造成對肝細胞的破壞，使肝細胞膜表面的脂質成分過度氧化，從而破壞了肝細胞膜。酒精不但可以損傷肝細胞，還可造成肝臟毛細膽管的損傷，或誘導自身抗體的產生。在本文研究中，先天性膽道閉鎖患者有1例ANA陽性。先天性膽道閉鎖是由于先天性膽道發(fā)育障礙引起的膽道梗阻，此外，有人提出本病與自身免疫、膽管缺血有關。還有人發(fā)現膽道閉鎖與硬化性膽管炎有相似的炎癥過程，發(fā)病率女性較男性高［14］，由此可能說明有ANA陽性的可能性。本文研究中，脂肪肝、藥物性肝炎患者未發(fā)現自身抗體。

既往由于對ALD認識的不足、實驗條件及檢測水平限制，遇有肝功能異?；颊撸鄶翟\斷為病毒性肝炎，因此早期診斷對ALD診斷、治療及預后至關重要［15］。隨著實驗室技術發(fā)展，臨床醫(yī)生對ALD認識程度明顯提高，自身抗體的檢測越來越受到重視。臨床可根據患者自身特異性抗體的聯合檢測結果，更準確、快速的鑒別、診斷ALD與其他肝病，對于提高ALD的診斷率有著重要的意義。

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（本文編輯：楊軍）

Autoantibody test results analysis of 225 patients with liver disease

SUN Ping，TANG Zhi－qin，MU Hong．Department of Clinical Labortoary，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China

ObjectiveTo investigate the clinical value of autoantibodies detection in autoimmune liver disease（ALD）including autoimmune hepatitis（AIH），primary biliary cirrhosis（PBC）and primary sclerosing cholangitis（PSC）．MethodsFrom January 2013 to February 2014，225 patients from department of gastroenterology，department of hepatobiliary surgery and transplant surgery were collected．Antinuclear antibody（ANA），antismooth muscle antibody（SMA）and anti－mitochondrial antibody（AMA）were detected by indirect immunofluorescence method．Liver kidney microsomal antibody（LKM），liver cytosol－1（LC－1），soluble antigen／liver pancreatic（SLA／LP）and AMA－M2were tested by Europe and Mongolia blotting detection．The clinical datas were consulted and the detected results were analyzed statistically．ResultsThe positive rates of ANA，SMA，AMA，LKM，AMA－M2，SLA／LP and LC－1 in patients with ALD were 77．78%，7．41%，55．56%，7．41%，48．15%，7．41%and 3．70%，respectively．The positive rates of ANA，SMA，AMA，LKM，AMA－M2，SLA／LP and LC－1 in patients with other liver diseases were 26．26%，4．55%，11．11%，0．51%，5．05%，2．53%and 1．52%，respectively．There were statistical significance in the differences of positive rates of ANA，AMA，LKM，AMA－M2between ALD and other liver diseases group（Pall＜0．05）．ConclusionAutoantibodies of ALD have a higher detection rate，and they provide a reliable basis for clinicians to identify viral hepatitis，ALD and other liver diseases．

Liver disease；Autoimmune liver disease；Autoantibody

10.3969／j.issn.1674－7151.2014.02.009

2014－04－18）