潘寶龍 黃尤光 林明 李樹德 巫玲 高琨

結(jié)直腸癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化及表達(dá)缺失的研究

潘寶龍 黃尤光 林明 李樹德 巫玲 高琨

目的 檢測結(jié)直腸癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀況，分析其mRNA表達(dá)缺失情況，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測31份結(jié)直腸癌組織、29份正常腸黏膜組織的RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度，統(tǒng)計(jì)分析該基因甲基化程度與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系；以RT-PCR檢測各組中RASSF1AmRNA表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析該基因表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果結(jié)直腸癌組及對照組中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化發(fā)生率分別為67.7%和0.0%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度、分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P均＞0.05）；RASSF1AmRNA在31份結(jié)直腸癌組織中有6份表達(dá)缺失（19.35%），25份表達(dá)，在29份對照組織中全部表達(dá)，兩組間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；RASSF1AmRNA的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤的分化程度、分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P均＞0.05）。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中RASSFlA基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化與結(jié)直腸癌發(fā)生關(guān)系密切，可能是結(jié)直腸癌早期發(fā)生中的一個(gè)重要的分子機(jī)制，但與患者的年齡、性別及疾病的進(jìn)展無關(guān)。

RASSF1A基因；甲基化；表達(dá)缺失；結(jié)直腸癌

腫瘤的形成是一個(gè)多階段多步驟的過程，涉及眾多癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)［1］，闡明基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是揭示腫瘤發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵。甲基化是脊椎動(dòng)物DNA表觀遺傳學(xué)修飾的唯一天然方式，具有基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因印跡和X染色體失活等重要生物學(xué)功能。近年來，腫瘤發(fā)生發(fā)展的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，特別是DNA甲基化和組蛋白去乙?；c腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

RASSF1A基因位于染色體3p21.3，是RAS相關(guān)區(qū)域家族1（RAS-association domain family 1，RASSF1）基因的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄本［2］。自2000年以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對其生物學(xué)性狀和其在多種腫瘤中的表達(dá)情況、失活原因以及其抑癌機(jī)制等方面進(jìn)行了廣泛的研究，確認(rèn)了該基因失活與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。進(jìn)一步研究證實(shí)該基因可通過多種途徑抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡，表明RASSF1A具有抑癌基因的特性。

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國男、女性惡性腫瘤發(fā)病率排名中分別列第三位、第二位。自2000年以來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率有不斷上升趨勢（以結(jié)腸癌上升為主）。近年來，結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)研究［3-5］，主要集中于AKAP12、P16、DAPK等基因的研究，而對于RASSF1A基因的研究報(bào)道很少。

本文研究旨在以癌旁及正常組織為對照，檢測結(jié)直腸癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀況，以PCR-DNA測序驗(yàn)證檢測的可靠性，分析其啟動(dòng)子區(qū)甲基化后mRNA表達(dá)缺失情況，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的表觀遺傳學(xué)研究提供理論和事實(shí)依據(jù)，為早期診治、復(fù)發(fā)監(jiān)測、基因治療結(jié)直腸癌提供一條新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料結(jié)直腸癌標(biāo)本取自31例結(jié)直腸癌患者，為2007-2011年云南省腫瘤醫(yī)院和玉溪市人民醫(yī)院外科接受結(jié)直腸癌手術(shù)患者，所有患者均有明確的術(shù)后病理診斷。所有病例術(shù)前均未做過放、化療。其中，男18例，女13例，年齡31～76歲，中位年齡54歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；低分化腺癌16例，中分化腺癌11例，高分化腺癌4例；早期結(jié)直腸癌3例，進(jìn)展期結(jié)直腸癌28例。對照黏膜組織標(biāo)本29份，其中28份為與結(jié)直腸癌標(biāo)本同期獲得的遠(yuǎn)端（距癌組織5 cm以遠(yuǎn)）非腫瘤黏膜組織（以下簡稱遠(yuǎn)端黏膜）；1份為升結(jié)腸炎性包塊手術(shù)標(biāo)本中的正常結(jié)腸黏膜組織（以下簡稱正常黏膜）。其中男16例，女13例，年齡33～75歲，中位年齡52歲。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取采用酚-氯仿抽提法提取DNA。用日本UV-2450紫外分光光度計(jì)檢測其含量和純度，OD260／OD280均在1.6～1.8之間，均值1.74。

1.2.2 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾（甲基化修飾）采用Wiz-ard DNA Clean-up System試劑盒，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物根據(jù)GenBank序列及相關(guān)參考文獻(xiàn)［6-8］，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP）按照Herman等［6］提出的甲基化特異性PCR方法，每份標(biāo)本都分別用甲基化與非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增。其中，甲基化上游引物5＇-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3＇，下游引物5＇-GCTAACAAACGCGAACCG-3＇，擴(kuò)增目的片段長度為160 bp；非甲基化上游引物5＇-GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3＇，下游引物5＇-CACTAACAAACACAAACCAAAC-3＇，擴(kuò)增目的片段長度為171 bp。

1.2.5 結(jié)果判定PCR產(chǎn)物經(jīng)溴化乙啶瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像分析儀上觀察電泳結(jié)果。如甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化特異性引物無條帶擴(kuò)出，視為純合型甲基化；如兩對引物均擴(kuò)增出目的條帶，視為雜合型甲基化；以上兩種類型均視為甲基化陽性；如非甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而甲基化特異性引物無條帶擴(kuò)出，視為非甲基化。

1.2.6 DNA序列測定隨機(jī)選取2例結(jié)直腸癌RASSF1A基因甲基化和非甲基化PCR產(chǎn)物，純化后進(jìn)行測序驗(yàn)證（AB 13700測序儀，北京華大基因公司深圳分公司）。

1.2.7 組織總RNA的提取及cDNA合成組織總RNA提取按照TRIZOL試劑盒操作說明書進(jìn)行（Inv itrogen公司），用日本UV-2450紫外分光光度計(jì)檢測其含量和純度，OD260／OD280均在1.7～2.0之間，均值1.82。以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，所用反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒為K 1622（Fearentas公司）。

1.2.8 半定量RT-PCR檢測mRNA基因表達(dá)使用引物設(shè)計(jì)軟件primer 5設(shè)計(jì)RASSF1A基因和內(nèi)對照基因GAPDH的RT-PCR引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。其中，RASSF1A mRNA上游引物5＇-GTTCTTGGTGGTGGATGACC-3＇，下游引物5＇-CCTT-CAGGACAAAGCTCAGG-3＇，擴(kuò)增目的片段長度為342 bp；GAPDH上游引物5＇-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3＇，下游引物5＇-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3＇，擴(kuò)增目的片段長度為260 bp。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行積分吸光度測定，計(jì)算組織中RASSF1A基因mRNA半定量表達(dá)值。RASSF1A基因mRNA半定量表達(dá)值＝RASSF1A積分光吸收值／GAPDH積分光吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以χ2檢驗(yàn)分析組間RASSF1A基因甲基化差別及與各臨床病理特征之間的關(guān)系；RASSF1A mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)使用表示，組間比較進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲基化檢測結(jié)果31例結(jié)直腸癌組織中有21例出現(xiàn)甲基化條帶，甲基化發(fā)生率67.7%（21／31）。29例對照組織中均為非甲基化條帶，甲基化發(fā)生率0.0%。兩組間甲基化發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝30.223，P＜0.01），見圖1、2。

圖1 結(jié)直腸癌組RASSF1A基因MSP反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 對照組RASSF1A基因MSP反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 測序結(jié)果在RASSF1A基因甲基化結(jié)直腸癌標(biāo)本中，其基因啟動(dòng)子CpG島的16個(gè)CpG位點(diǎn)均發(fā)生了甲基化，即CpG位點(diǎn)的C仍然保持C，而未甲基化結(jié)直腸癌標(biāo)本中，CpG島的C全部轉(zhuǎn)變?yōu)門，見圖3。

圖3 測序圖：RASSF1A基因甲基化者CpG島中的C在未甲基化者均轉(zhuǎn)變?yōu)門

2.3 RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系由表1可見，結(jié)直腸癌組織中，RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P均＞0.05）。

2.4 RASSF1AmRNA在結(jié)直腸癌組織及對照組織中的表達(dá)RASSF1AmRNA在31例結(jié)直腸癌組織中有6例表達(dá)缺失（19.35%），25例表達(dá)，riOD為0.6971±0.2648，而在29例對照組織中全部表達(dá)，ri-OD為1.1417±0.2013，癌組織與對照組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.9986，P＜0.01），見圖4。

圖4 RASSF1AmRNA在結(jié)直腸癌組織及對照組織中表達(dá)的凝膠電泳圖

2.5 結(jié)直腸癌組織中RASSF1AmRNA表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系由表2可見，結(jié)直腸癌組織中RASSF1AmRNA表達(dá)水平與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P均＞0.05）。

表1 RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與結(jié)直腸癌臨床病理特征的分析［n（%）］

表2 結(jié)直腸癌RASSF1AmRNA表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

表2 結(jié)直腸癌RASSF1AmRNA表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

臨床資料例數(shù)riOD值t值或F值P值男18 0.6821±0.2836性別0.1784＞0.05女13 0.6520±0.2571年齡（歲）≤55 9 0.6426±0.2979 0.3689＞0.05＞55 22 0.6833±0.2712高4 0.6513±0.2556分化程度17.4146＞0.05中11 0.6908±0.2322低16 0.7018±0.2471腫瘤分期I、II期3 0.6728±0.2283 0.4047＞0.05 III、IV期28 0.6016±0.2936無14 0.6851±0.2725淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.6261＞0.05有17 0.6232±0.2647

3 討論

RASSF1A在正常組織中幾乎全部表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯降低或缺失。大量研究［7-9］表明，RASSF1A在腫瘤中表達(dá)失活主要是由于其啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化所致。DNA甲基化是具有可逆性與遺傳性的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式。CpG島即CpG核苷酸集中的區(qū)域，其最顯著的特征是保持嚴(yán)格的非甲基化，一般位于第一外顯子及啟動(dòng)子區(qū)，當(dāng)其發(fā)生甲基化，可通過多種機(jī)制抑制基因轉(zhuǎn)錄造成基因表達(dá)缺失。RASSF1A未表達(dá)的腫瘤標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)其體細(xì)胞突變現(xiàn)象。由此可見，啟動(dòng)子區(qū)甲基化也是RASSF1A基因在結(jié)直腸癌中失活的重要原因。

本文研究采用MSP技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況，結(jié)果顯示29例對照組標(biāo)本均未發(fā)生RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在結(jié)直腸癌組發(fā)生率為67.7%，顯著高于對照組（P＜0.01）。RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化在結(jié)直腸癌中出現(xiàn)頻率之高，提示其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用，可能是參與結(jié)直腸癌形成的一個(gè)重要分子機(jī)制。

DNA甲基化的檢測有多種方法，MSP是敏感性特異性較好、操作又相對簡便的CpG島甲基化檢測方法［10］。根據(jù)胞嘧啶經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?、而甲基化的胞嘧啶不能轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏さ脑?，針對目的CpG島設(shè)計(jì)甲基化和未甲基化特異性引物，以敏感高效的DNA擴(kuò)增方法PCR進(jìn)行目的CpG島的擴(kuò)增，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定來確定目的CpG島是否發(fā)生甲基化。該方法經(jīng)過不斷的改進(jìn)，目前已成為一種快速、敏感、實(shí)用的基因甲基化分析方法，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，能同時(shí)檢測多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，是目前國際上比較通用的CpG島甲基化檢測方法。

結(jié)直腸癌的發(fā)生是個(gè)漸進(jìn)過程，在發(fā)展為惡性腫瘤之前，常經(jīng)歷多年持續(xù)癌前病變。一些關(guān)于RASSF1A基因甲基化在胃良性病變及癌前病變中的研究［11-12］結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASSF1A甲基化現(xiàn)象在結(jié)直腸癌中出現(xiàn)頻繁，而在胃腺瘤、腸上皮化生及慢性胃炎等癌前病變中出現(xiàn)很少。從本文研究RASSF1A基因甲基化與臨床病理特征相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示RASSF1A甲基化可能只是結(jié)直腸癌早期發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要的分子機(jī)制，一旦早期形成后，并不隨其他臨床病理改變而發(fā)生大的變化。

DNA的甲基化可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而引起不同的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合。啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化可引起甲基化CpG結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄抑制物組蛋白已酞化酶等結(jié)合到CpG島，從而阻斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到啟動(dòng)子上，抑制基因的表達(dá)。因此，目前認(rèn)為，啟動(dòng)子區(qū)的超甲基化、雜合性丟失及等位基因缺失是RASSF1A失活的主要機(jī)制，而突變并不是很常見。

為了探討RASSF1A基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，本文研究采用RT-PCR法檢測了31例結(jié)直腸癌組織及29例正常大腸黏膜組織中該基因的表達(dá)，結(jié)果表明，RASSF1AmRNA在31例結(jié)直腸癌組織中有6例表達(dá)缺失（缺失率19.35%），25例表達(dá)，riOD為0.6971±0.2648，而在29例對照組織中全部表達(dá)，riOD為1.1417±0.2013，癌組織與對照組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.9986，P＜0.01）。這說明RASSF1A表達(dá)缺失或下調(diào)是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的一個(gè)常見事件，其啟動(dòng)子區(qū)甲基化與其表達(dá)缺失明顯相關(guān)，可能是導(dǎo)致其表達(dá)缺失或下調(diào)的主要原因。然而，在對RASSF1A表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與患者性別、年齡無關(guān)（P均＞0.05），同時(shí)，在腫瘤分化程度、分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），說明RASSF1A基因表達(dá)缺失可能是結(jié)直腸癌早期發(fā)展中的一個(gè)分子事件，而與患者性別年齡及疾病后期進(jìn)展沒有關(guān)系。

綜上所述，RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化及表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，可能是結(jié)直腸癌早期發(fā)展中的一個(gè)重要因素，但與患者性別年齡及一些臨床病理特征無明顯關(guān)系。隨著對RASSF1A基因研究的深入，必將在腫瘤的發(fā)生機(jī)制、分子水平監(jiān)測以及基因治療惡性腫瘤方面提供新的參考依據(jù)。

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Research on promoter methylation and expression deletion of RASSF1A in patients with colorectal cancer

PAN Bao-long1，HUANG You-guang2，LIN Ming1，etal.1DepartmentofClinical Laboratory，People＇s Hospitalof YuxiCity，Yuxi653100，China2DepartmentofOncology Institute，Tumour Hospitalof Yunnan，Kunming650031，China

ObjectiveTo detect the RASSF1A gene CpG islandmethylation status in colorectal cancer，analyze themRNA expression，and to investigate its relationship with clinicopathological features of colorectal cancer.MethodsRASSF1A gene promoter areamethylation statuswere detected by usingmethylation-specific polymerase chain reaction in 31 casesof colorectal cancermucosa tissue，29 casesofnormalmucosa tissue.The relationship between methylation and clinicopathological features was analyzed statistically. RASSF1AmRNA expression in each group were detected by RT-PCR，The correlation between gene expression levelwith clinicopathological characteristics of colorectal cancerwas analyzed statistically.ResultsThe positive rate ofRASSF1A gene CpG islandmethylation was67.7%in colorectal cancer group and 0.0%in corresponding controlgroup，and the difference had statistical significance（P＜0.01）.Therewere no correlation between RASSF1Amethylation rate and clinicopathological features including age，sex，degree of tumor differentiation，staging and lymph nodemetastasis（P all＞0.05）.In 31 cases of colorectal cancer tissues，there were 6 casesofRASSF1AmRNA expression deletion（19.35%），while in 29 casesof control tissue，RASSF1A mRNA were all expressed.There was statistical significance in the difference of expression level between the twogroups（P＜0.01）.Therewereno correlation between RASSF1AmRNA expression leveland clinicopathological features includingage，sex，degreeof tumor differentiation，staging and lymph nodemetastasis（P all＞0.05）.ConclusionThe highmethylation rate of RASSF1A in colorectal cancer indicates its closely relationship with colorectal canceroccurrence，itmay be an importantmolecularmechanism in early onsetof colorectalcancer.But there isno correlationwith age，genderand progression ofcolorectalcancer.

RASSF1A gene；Methylation；Expression deletion；Colorectalcancer

10.3969／j.issn.1674－7151.2014.04.003

2014-07-18）

（本文編輯：楊軍）

653100 玉溪市，玉溪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（潘寶龍林明巫玲高琨）

650031 昆明市，云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所（黃尤光）

650500 昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)科（李樹德）