殷秀辰，哈 卓，李 星，張清真，劉惠莉

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

含粘膜佐劑的雞新城疫疫苗誘導(dǎo)雛雞非特異性免疫應(yīng)答的研究

殷秀辰1,2，哈 卓1，李 星1，張清真1，劉惠莉1,2

（1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

為研究分析重組大腸桿菌不耐熱腸毒素（labile enterotoxin，LT）作為粘膜佐劑，配伍雞新城疫疫苗的凍干樣品對免疫雞非特異性免疫應(yīng)答的影響，在前期已經(jīng)構(gòu)建的LTR72/G192基礎(chǔ)上，選擇2、4 μg LTRG蛋白作為每羽份疫苗添加量，及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV） 50%抗原量等配伍條件。按照生產(chǎn)條件制備凍干疫苗，進行雛雞免疫試驗，免疫后24、48、72 h采集脾臟、胸腺淋巴結(jié)，檢測幾種非特異性細胞因子表達水平。結(jié)果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24 h即升高，48 h達最高值；添加2、4 μg LTRG蛋白的NDV疫苗組IFN-β、TNF-α水平在48 h左右顯著升高，其中含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；IL-6、IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平有所增強，但各組間差異不具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），72 h左右?guī)追N細胞因子水平均迅速下降，與NDV疫苗接種組相近。由此可見，LTRG能輔助抗原誘導(dǎo)免疫雛雞的非特異性免疫應(yīng)答，有利于對感染病毒的清除。

LTRG；新城疫病毒；佐劑；細胞因子

大腸桿菌不耐熱腸毒素（labile enterotoxin，LT）是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分泌的一種毒素蛋白，被認為是最具潛力的黏膜佐劑[1-3]。但LT的毒性限制了其應(yīng)用，采用點突變可獲得減毒甚至無毒的LT突變體，從而制備無毒LT蛋白[4]。

本實驗室之前已經(jīng)對LT進行了雙突變體并成功表達了該蛋白，命名為LTRG（R72/G192），對重組蛋白的生物學(xué)特性、免疫佐劑活性進行了相關(guān)研究[5]，主要針對其與疫苗共免疫后的黏膜抗體IgA，血清抗體IgG的一些特異性免疫應(yīng)答方面進行的評價。

非特異性免疫是機體在長期進化過程中與病原微生物相互作用，逐漸建立起來的一系列防御功能。宿主的抗病原應(yīng)答反應(yīng)強度與干擾素（interferon，IFN）及腫瘤細胞壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等細胞因子的濃度密切相關(guān)[6]。IFN是一種類似多肽激素的物質(zhì)，具有廣譜抗病毒和細胞調(diào)節(jié)功能的細胞因子。TNF是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白，具有多種生物學(xué)功能，與抑制病毒復(fù)制、病毒顆粒的產(chǎn)生和感染性方面關(guān)系密切，并可殺傷病毒感染細胞[6,7]。白細胞介素（interleukin，IL）在免疫過程中也能夠激活和調(diào)節(jié)免疫細胞，能夠介導(dǎo)T、B淋巴細胞的活化、增殖及分化[8]。

本文采用LTRG蛋白與新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）活疫苗配伍免疫雛雞，通過熒光定量PCR分別檢測IFN、TFN以及IL-6的水平，研究LTRG對非特異性免疫應(yīng)答的影響。

1 材料方法

1.1 材料新城疫活疫苗（NDV，LaSota）為上海海利公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：1206016，病毒效價為109.75TCID50；凍干保護劑：10%牛奶保護劑，批號：20121129；LTRG蛋白為本實驗室純化保存，濃度為1 mg/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 凍干樣品制備 采用PBS將新城疫疫苗稀釋，終濃度為2羽份/mL凍干疫苗1：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:4；凍干疫苗2：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:2；凍干疫苗3：NDV疫苗抗原與LTRG蛋白比例為1.5:4。

1.2.2 動物實驗 50羽1日齡雛雞飼養(yǎng)于消毒的潔凈環(huán)境中，不接種任何疫苗及藥物，至7日齡按表1分組，滴鼻免疫。

免疫后24、48、72 h每組分別處死2只雞，采胸腺淋巴結(jié)和脾臟，用于檢測細胞因子。

1.2.3 熒光定量PCR方法建立

1.2.3.1 引物設(shè)計及PCR體系和退火溫度的篩選 根據(jù)GenBank中登錄的雞細胞因子IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6核苷酸序列，選擇保守序列區(qū)作為擴增區(qū)域，采用BLAST軟件程序和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程公司合成，信息見表2。

表1 雛雞試驗分組Table 1 The group of chickens

表2 Real-time PCR 所用引物及產(chǎn)物片段長度Table 2 The primers used in Real-time PCR and length of fragment

通過優(yōu)化各組分比例及退火溫度等條件，建立PCR反應(yīng)體系。20 μL反應(yīng)液：模板1 μL、buffer 2 μL，上游引物終濃度為200 nmol/L，下游引物終濃度為200 nmol/L。

分別采用64.0℃、63.1℃、61.5℃、58.9℃、55.3℃、52.8℃、51.1℃和50.0℃ 8個溫度梯度對Real-time PCR反應(yīng)退火溫度進行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.3.2 質(zhì)粒標準品構(gòu)建及標準曲線的建立 提取健康雞脾臟RNA，采用設(shè)計的引物進行RT-PCR，擴增各細胞因子基因，回收克隆至T載體，經(jīng)序列測定正確后，作為質(zhì)粒標準品。

將質(zhì)粒標準品稀釋100倍，測定質(zhì)粒濃度，并根據(jù)公式轉(zhuǎn)化為測定樣品中的質(zhì)?？截悢?shù)。將拷貝數(shù)為2×108的質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，共稀釋5個梯度：2×108～2×103copies/μL。用優(yōu)化的Realtime PCR反應(yīng)體系擴增不同濃度模板繪制標準曲線。

1.3 Real-time PCR檢測采用Trizol提取采集的雞脾臟和胸腺淋巴結(jié)組織IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6 RNA，加入DEPC水溶解后反轉(zhuǎn)錄，通過建立的Real-time PCR對其轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。采用優(yōu)化的反應(yīng)程序進行擴增。通過相對定量的分析，比較不同免疫組之間引起的細胞因子的組間差異表達。結(jié)果采用SPSS軟件進行差異統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 最佳循環(huán)參數(shù)確定經(jīng)優(yōu)化，定量PCR擴增條件如下：95℃度預(yù)變性2 min；95℃ 變性15 s，57℃退火30 s，延伸30 s，40個循環(huán)。PCR儀于延伸階段采集熒光信號。

2.2 細胞因子擴增與溶解曲線四種細胞因子擴增效果理想，擴增曲線均在理想循環(huán)參數(shù)內(nèi)。溶解曲線重合率高，顯示擴增目的基因均一性好（圖1）。

2.3 胸腺淋巴結(jié)細胞因子檢測對IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6四種細胞因子檢測發(fā)現(xiàn)，免疫后d 2，第一、二組細胞因子轉(zhuǎn)錄均明顯上升，其中第一組配伍疫苗IFN-γ、TNF-α、IL-6與疫苗組差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。結(jié)果表明，2、4 μg LTRG 均能促進細胞因子轉(zhuǎn)錄，增強非特異性免疫應(yīng)答能力。

2.4 脾臟細胞因子檢測雛雞免疫后，檢測脾臟細胞因子轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫后24 h，4 μg LTRG免疫劑量能顯著增強IFN-β轉(zhuǎn)錄水平，與NDV對照組差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；免疫后48 h，IFN-γ、IL-6 轉(zhuǎn)錄水平顯著增強，高于2 μg LTRG添加組及NDV疫苗組，但差異不具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；免疫后72 h，4 μg LTRG 添加疫苗組TNF-α轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，與NDV疫苗組差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 四種細胞因子擴增圖Fig.1 The amplifi cation of four cytokines by Real-time PCR

3 討論

佐劑（Adjuvant）是一類先于抗原或與抗原同時注入機體，從而非特異性地增強或者改變機體對抗原免疫應(yīng)答的物質(zhì)[9,10]。佐劑誘導(dǎo)抗原提呈細胞（APC）分泌細胞因子，可刺激CD4+T細胞分化為Thl與Th2兩種亞型。其中Thl細胞可以分泌白細胞介素2 （IL-2）以及干擾素γ(IFN-γ)，促進B細胞特異性抗體IgG2的分泌，并介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答。Th2細胞能夠產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6以及IL-10，以促進B細胞產(chǎn)生高水平的IgG和IgE[8,11]。

干擾素的主要作用是抗病毒及免疫調(diào)節(jié)[7]。研究證實，感染發(fā)生前，IFN-β有預(yù)防作用；感染發(fā)生后，IFN-β有治療作用[12]。IFN-γ可使巨噬細胞表面MHCⅡ類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。IFN-γ對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用等，尤其是IFN-γ能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能[13,14]。

圖2 胸腺淋巴結(jié)細胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測Fig.2 The detection result of the cytokines of thymus lymph node by Real-time PCR

圖3 脾臟細胞因子定量檢測Fig.3 The quantitative detection of the cytokines in spleens

本研究采用Real-time PCR對胸腺和脾臟的IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6進行定量分析。結(jié)果表明，4種細胞因子在添加LTRG組中的轉(zhuǎn)錄情況要明顯高于未添加組。胸腺中，4種細胞因子的水平在各疫苗免疫后48 h達最高值，含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在脾臟中，含4 μg LTRG疫苗組與其他組差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義，添加2 μg LTRG疫苗組與其他差異不具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。說明LTRG蛋白可以增強機體對疫苗的免疫應(yīng)答能力，誘導(dǎo)各種細胞因子的表達顯著增加。同時，細胞因子能夠刺激B淋巴細胞的分泌抗體，較高的細胞因子能夠刺激機體產(chǎn)生較高的抗體水平。本研究結(jié)果證明含有LTRG疫苗佐劑的新城疫疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生較高的非特異性免疫反應(yīng)，對機體產(chǎn)生保護作用。

[1] 趙艷敏,劉惠莉. 大腸埃希菌不耐熱腸毒素作為黏膜免疫佐劑的研究進展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展,2007(3): 46-50.

[2] 唐思靜,劉惠莉,馬勛,等. 大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體的原核表達及其活性研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2012,32(9): 697-701.

[3] 唐思靜,劉惠莉. 大腸埃希菌熱敏性腸毒素B亞基研究進展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展,2008,29 (2): 68-71.

[4] Eun J P,Hoon C,Jang S K,et al. Development of two novel nontoxic mutants of Escherichia coli heat-labile enterotoxin [J]. Exper Molec Medic,1993,31(2): 101-107.

[5] 唐思靜,哈卓,趙艷敏,等. LT粘膜佐劑對雞新城疫疫苗的免疫增強作用研究[J]. 中國動物傳染病學(xué)報,2013,21(1): 8-11.

[6] Levy D E,Garcia-sastre A. The virus battles: IFN induction of the antiviral state and mechanisms of viral evasion[J]. Cytokine Growth Factor Rev,2001,12(2-3): 143-156.

[7] 杜念興. 獸醫(yī)免疫學(xué)[M]. 2版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1997,17-18.

[8] Pichichero M E. Improving vaccine delivery using novel adjuvant systems[J]. Hum Vaccin,2008,4(4): 262-270.

[9] O’Hagan D T,De Gregorio E. The path to a successful vaccine adjuvant--'the long and winding road'[J]. Drug Discov Today,2009,14(11): 541-551.

[10] Degen W Q,Jansen T,Schijns V E. Vaccine adjuvant technology: from mechanistic concepts to practical applications[J]. Expert Rev Vaccines,2003,2(2): 327-335.

[11] Perrie Y,Mohammed A R,Kirby D J,et al. Vaccine adjuvant systems: enhancing the efficacy of sub-unit protein antigens[J]. Int J Pharm,2008,364(2): 272-280.

[12] Shtrichman R,Samuel C E. The role of gamma interferon in anti-microbial immunity[J]. Curr Opin Microbiol,2001,4 (3): 251-259.

[13] Hein J,Schellenberg U,Bein G,et al. Quantification of murine IFN-γ mRNA and protein expression: impact of real-time kinetic RT-PCR using SYBR Green I dye [J]. Scand J Immunol,2001,54(3): 285-291.

[14] Peinnequin A,Mouret C,Birot O,et al. Rat proinflammatory cytokine and cytokine related mRNA quantification by real-time polymerase chain reaction using SYBR green[J]. BMC immunol,2004,5: 3.

ADDITION OF HEAT-LABILE ENTEROTOXIN AS ADJUVANT TO NEWCASTLE DISEASE VACCINE ENHANCES NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSES IN CHICKENS

YIN Xiu-chen1,2,HA Zhuo1,LI Xing1,ZHANG Qing-zhen1,LIU Hui-li1,2
(1. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetic Breeding,Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shanghai Academy of Agricultural Science,Shanghai 201106,China; 2. Shanghai Jiamu Bio-product Co. Ltd.,Shanghai 201106,China)

In the present study,heat-labile enterotoxin (LT) was used as adjuvants for Newcastle disease virus (NDV) vaccine to investigate if non-specifi c immune responses were enhanced in vaccinated chickens. The formulation procedure was to add 2 μg or 4 μg LTRG to one dose of NDV vaccine or 4 μg LTRG to half dose of vaccine followed by freeze-drying cycles. The aduvanted NDV vaccines were orally administered to chickens. At 24,48 h and 72 h post vaccination,spleens,thymuses and lymph nodes were collected and levels of IL-6,INF-γ,IFN-β and TNF-α were detected in Real-time PCR. The results showed that IL-6 and INF-γ of all vaccinated chickens started to rise at 24 h and peaked at 48 h post vaccination while IFN-β and TNF-α did not signifi cantly increase till 48 h post vaccination.In addition,chickens vaccinated with NDV vaccine containing 4 μg LTRG developed significantly (P＜0.01) higher IL-6 and INF-γ responses than NDV alone controls. The transcription levels of IL-6 and INF-γ increased but difference among groups was not signifi cant (P＞0.05). In conclusion,addition of LTRG to NDV vaccine enhanced non-specifi c immune responses in vaccinated chickens.

LTRG; Newcastle disease virus; adjuvant; cytokines

S852.659.5

A

1674-6422（2014）05-0035-06

2014-07-05

上海市科委農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項目（1239019N0800）；上海市農(nóng)委攻關(guān)項目（滬農(nóng)科攻字(2008)第8-6號；滬農(nóng)科攻字(2010)第2-4號）

殷秀辰，男，碩士，主要從事病毒分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究

劉惠莉，E-mail：huilil@163.com