1.湖南邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 邵陽 422000 ；

2.湖南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410013

TNFAIP3基因在放射治療鼻咽癌中的表達(dá)及意義

鄧香群1葉旭2

1.湖南邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，湖南 邵陽 422000 ；

2.湖南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410013

背景與目的：鼻咽癌多對(duì)放射治療敏感，研究鼻咽癌放療抗拒具有重要意義。本研究旨在探討腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha induced protein 3，TNFAIP3)在經(jīng)放射治療的鼻咽癌中的表達(dá)，分析其在放療敏感及放療抗拒的鼻咽癌中表達(dá)的差異，與放療抗拒發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法：采用TNFAIP3多點(diǎn)標(biāo)記的地高辛探針原位雜交方法檢測(cè)TNFAIP3 mRNA在放療敏感及放療抗拒的鼻咽癌中的表達(dá)。結(jié)果：TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率在放療敏感及放療抗拒的鼻咽癌中的表達(dá)率分別為15.00%和45.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.274，P=0.0216)。在放療抗拒的鼻咽癌中，TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率與TNM分期呈正相關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率為48.28%，I～Ⅱ期表達(dá)率為36.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.240，P＜0.005)；在有、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的表達(dá)率分別為81.81%和31.03%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.385，P=0.011 5)。結(jié)論：TNFAIP3雖具有抗腫瘤效應(yīng)，但參與了放療抗拒的鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

TNFAIP3基因；放療敏感；放療抗拒；鼻咽癌

鼻咽癌的治療以放療為主，且對(duì)放療相對(duì)敏感。因此，研究放療抗拒的鼻咽癌非常必要。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factoralpha induced protein 3，TNFAIP3)，即鋅指蛋白A20，是一種具有抗細(xì)胞凋亡及抑制核轉(zhuǎn)錄因子кB(nuclear transcription factor-кB，NF-кB)活化雙重功能的蛋白［1］。A20有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：具有鋅指結(jié)構(gòu)的C末端和具有特征性結(jié)構(gòu)的N端，其鋅指區(qū)主要抑制NF-кB 的功能。TNFAIP3與TNFAIP3相互作用蛋白質(zhì)1(TNFAIP3 interacting protein-1，TNIP1)編碼的蛋白彼此結(jié)合，阻止NF-кB活化和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF) 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［2］。在炎性反應(yīng)因子或病原體作用下，細(xì)胞膜通過Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和TNF受體傳遞活化NF-кB信號(hào)，A20與NF-кB抑制蛋白(A20 binding inhibitor of NF-кB，ABIN)-1結(jié)合，阻止NF-кB活化［3］，通過阻斷NF-кB信號(hào)通路，獲得抗炎和抗腫瘤效應(yīng)［4-5］。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集湖南省腫瘤醫(yī)院2006年首次入院的鼻咽癌患者60例，所有患者都有3年或以上隨訪記錄，其中放療抗拒40例，放療敏感20例，放療抗拒者均伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。放療抗拒標(biāo)準(zhǔn)：①根治性放療后3個(gè)月復(fù)查原發(fā)灶和(或)淋巴結(jié)殘留；②根治性放療后1年內(nèi)出現(xiàn)鼻咽新事物和(或)新發(fā)淋巴結(jié)；③放療后13～24個(gè)月出現(xiàn)復(fù)發(fā)。診斷依據(jù)：①臨床癥狀+體征；②鼻咽+頸部MRI或CT(平掃+增強(qiáng))；③復(fù)發(fā)病理診斷。放療敏感標(biāo)準(zhǔn)：①根治性放療后3個(gè)月復(fù)查原發(fā)灶和(或)淋巴結(jié)無殘留；②根治性放療后1年內(nèi)未出現(xiàn)鼻咽新事物和(或)新發(fā)淋巴結(jié)；③放療后13～24個(gè)月未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移；④隨訪3年或以上無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑

為減小施工過程中塔柱根部拉應(yīng)力，在塔柱第九節(jié)混凝土頂部（+52.450m）設(shè)置一道主動(dòng)臨時(shí)橫撐。第一層橫梁混凝土完成澆筑，混凝土強(qiáng)度達(dá)到設(shè)計(jì)強(qiáng)度的90%后，即拆除臨時(shí)橫撐，進(jìn)行第一次預(yù)應(yīng)力施工，爬架同時(shí)正常爬升，施工中塔柱節(jié)段。

1.3 原位雜交檢測(cè)

探針及試劑盒均購自天津?yàn)笊锕?，TNFAIP3探針合成序列：5’-ATTGCCGTCA CCGTTCGTTTTCAGCG-3’；5’-AGTTG CGTGTGTCTGTTTCCTTGAGCG-3’；5 ’ -T G T C C C A T T C A T C A T T C C AGTTCCGAG-3’。試劑：寡核苷酸探針預(yù)雜交液；寡核苷酸探針雜交液TNFAIP3；寡核苷酸陰性探針雜交液TNFAIP3；復(fù)合消化液(P/E)PH為6.4；生物素標(biāo)記的小鼠抗地高辛；高敏過氧化物酶鏈親和素復(fù)合物；2xssc干粉。

AI機(jī)巡平臺(tái)、物聯(lián)網(wǎng)、高溫超導(dǎo)、智慧電網(wǎng)、光場(chǎng)攝影技術(shù)、裸眼3D全息技術(shù)、液態(tài)金屬3D打印、石墨烯材料技術(shù)、X射線機(jī)器人……在實(shí)物展區(qū)，131個(gè)展位以實(shí)物、展板、模型、影像、現(xiàn)場(chǎng)解說及現(xiàn)場(chǎng)演示互動(dòng)相結(jié)合等形式展示著高新技術(shù)、設(shè)備、工具及軟件四大類科技成果。

企業(yè)內(nèi)部財(cái)務(wù)控制措施能否全面徹底執(zhí)行，與領(lǐng)導(dǎo)的表率作用關(guān)系密切。酒店上至總經(jīng)理，下至各級(jí)管理人員，在執(zhí)行各項(xiàng)成本控制管理制度規(guī)定方面以身作則，積極主動(dòng)。酒店對(duì)領(lǐng)導(dǎo)在酒店的消費(fèi)有著嚴(yán)格的控制，除確屬酒店應(yīng)酬外需由總經(jīng)理簽字確認(rèn)列酒店開支外，其余任何人員都無權(quán)簽單，為任何人員提供免費(fèi)的服務(wù)。

TNFAIP3多點(diǎn)標(biāo)記的地高辛探針原位雜交法：石蠟切片脫蠟至水，置打孔液中室溫10 min，置過氧化氫封閉液室溫20 min，封閉內(nèi)源性過氧化氫酶；滴加復(fù)合消化工作液，覆蓋組織表面，室溫10～30 min；滴加預(yù)雜交工作液覆蓋組織37 ℃濕盒溫育2 h；預(yù)雜交后的洗滌。滴加雜交工作液覆蓋組織37 ℃濕盒溫育8 h，雜交后的洗滌。滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液，覆蓋組織37 ℃濕盒溫育45 min，滴加高敏過氧化物酶鏈親和素復(fù)合物工作液，覆蓋組織37 ℃濕盒溫育45 min。DAB顯色，細(xì)胞質(zhì)顯棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核為藍(lán)色。脫水，封片。

1.4 結(jié)果判定

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率的比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分析TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率與TNM分期之間相關(guān)性采用Φ系數(shù)。

2.1 TNFAIP3 mRNA在放射治療鼻咽癌中的表達(dá)

在放療抗拒及放療敏感的鼻咽癌患者中，TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為45.00%和15.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.274，P＜0.05，表1)。

顯微鏡下觀察，TNFAIP3 mRNA細(xì)胞質(zhì)顯棕黃色為陽性反應(yīng)。按陽性細(xì)胞所占比率記錄：著色細(xì)胞＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色深度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)兩者相乘的積綜合判斷，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

2 結(jié) 果

“前些日，我們行蹤暴露，唐烈再次派人對(duì)我們展開了追殺。這一次，他派出了唐門三公子唐飛蔭和五公子唐飛霄。二人皆出自奇門遁甲流，奇門為術(shù)數(shù)陣法，遁甲為機(jī)械機(jī)關(guān)。唐飛蔭擅奇門之術(shù)，深諳師父的陣法防御之道，而唐飛霄的機(jī)甲術(shù)攻防兼?zhèn)洌c奇門之術(shù)配合無間，我們根本無法抵擋。師父拼盡全力，最終與唐飛蔭同歸于盡，為我爭取了逃生的機(jī)會(huì)?！?/p>

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.2 TNFAIP3 mRNA在放療抗拒的鼻咽癌患者中的表達(dá)

當(dāng)然，用過去在消費(fèi)互聯(lián)網(wǎng)的巨大成功后攢下的本錢，大批量地從央企、國企挖人補(bǔ)“工業(yè)基因”，從工業(yè)軟件企業(yè)挖人補(bǔ)“工業(yè)軟件基因”，從院所和組織挖人補(bǔ)“研究基因”，倒是一直在如火如荼地進(jìn)行。但是工資待遇加倍的結(jié)果是，人才好挖，知識(shí)難得，有一座“知識(shí)壁壘”珠峰橫亙?cè)谀抢?，搬不走，挪不?dòng)，也唱不了現(xiàn)代版的“愚公移峰”，只能花費(fèi)時(shí)間、資金和毅力去慢慢爬，去細(xì)細(xì)沉淀，但這需要大量時(shí)間。

陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃、棕色(圖1～4)。隨TNM分期不同，TNFAIP3 mRNA中度及強(qiáng)陽性表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)，并與TNM分期呈正相關(guān)(χ2=33.240，P＜0.005)，兩者關(guān)聯(lián)強(qiáng)度為0.000 2；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.385，P＜0.05，表2)。

表 1 TNFAIP3在放射治療鼻咽癌中的表達(dá)Tab. 1 TNFAIP3 expression in radiotherapeutic nasopharyngeal carcinoma

圖 1 TNFAIP3在放射治療鼻咽癌中的表達(dá)Fig. 1 TNFAIP3 expression in radiotherapeutic nasopharyngeal carcinoma

表 2 TNFAIP3與放療抗拒的鼻咽癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 The relationship between TNFAIP3 and clinicopathological parameters of radioresistant nasopharyngeal carcinoma

3 討 論

TNFAIP3基因位于6q23，全長約15.9 kbp，含9個(gè)外顯子，與人類多種疾病相關(guān)，有望成為抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的新靶點(diǎn)［6］，其5’上游具有多個(gè)保守的核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，-54和-66 bp處各有一個(gè)NF-кB結(jié)合區(qū)。在眼附屬器的淋巴瘤，TNFAIP3所在的6q23位點(diǎn)發(fā)生純合子缺失，TNFAIP3的功能缺損可能是腫瘤發(fā)病機(jī)制之一［7］。亦有研究表明，TNFAIP3抗炎活性的增加可能減弱TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8］。干擾TNFAIP3在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)，可抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞的活化能力，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制作用［9］；TNFAIP3還可能通過去泛素化對(duì)T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)控［10-11］。B細(xì)胞功能異常及變異與NF-кB經(jīng)典及非經(jīng)典信號(hào)通路激活相關(guān)，TNFAIP3在調(diào)節(jié)B細(xì)胞活動(dòng)中的作用包括限制NF-кB活化信號(hào)以及保持自身反應(yīng)性B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及預(yù)防自身免疫［12］。研究顯示，乳腺癌的發(fā)病進(jìn)展中增強(qiáng)的TNFAIP3表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡作用，促進(jìn)了瘤細(xì)胞的存活［13］。

本實(shí)驗(yàn)中，放療抗拒的鼻咽癌中TNFAIP3 mRNA中度陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率為45.00%，放療敏感的鼻咽癌中的表達(dá)率為15.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。放療敏感的鼻咽癌細(xì)胞中TNFAIP3具有抗腫瘤效應(yīng)，這種作用可能主要通過抑制NF-кB活化實(shí)現(xiàn)，阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄過程，維持了自身反應(yīng)性B細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。TNFAIP3的抗腫瘤效應(yīng)受細(xì)胞類型影響，放療抗拒鼻咽癌細(xì)胞中TNFAIP3可能發(fā)生純合子缺失，導(dǎo)致其抗腫瘤效應(yīng)缺損，引起鼻咽癌細(xì)胞放療抗拒性的發(fā)生。

40例放療抗拒的鼻咽癌患者中，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期TNFAIP3 mRNA中度陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率為48.28%，I～Ⅱ期為36.36%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者TNFAIP3 mRNA中度陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們認(rèn)為TNFAIP3參與了放療抗拒的鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移。炎性反應(yīng)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在放療抗拒的鼻咽癌的侵襲過程中，TNFAIP3過表達(dá)，TNFAIP3的抗炎活性增強(qiáng)，減弱了TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能，導(dǎo)致其出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。放射線輻射引起細(xì)胞DNA損傷，同時(shí)TNFAIP3基因的6q23位點(diǎn)純合子缺失，在富含炎性反應(yīng)細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)，加速了放療抗拒的鼻咽癌的發(fā)展進(jìn)程。TNFAIP3的過表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞毒T細(xì)胞的活化能力，加強(qiáng)了放療抗拒的鼻咽癌細(xì)胞的腫瘤免疫作用；同時(shí)放射線輻射產(chǎn)生大量的氧自由基，TNFAIP3基因參與了清除氧自由基的過程，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受氧化損傷。TNFAIP3可作為降低鼻咽癌放療抗拒性的靶基因之一。

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Expression of TNFAIP3 gene in radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma

DENG Xiang-qun1, YE Xu2(1.Department of Histology and Embryology, Shaoyang Medical College,Shaoyang Hunan 422000,China; 2.Department of Nuclear Medicine, Hunan Provincial Tumor Hospital,Changsha Hunan 410013, China)

DENG Xiang-qun E-mail: hnsydxq@126.com

Background and purpose: Nasopharyngeal carcinoma is sensitive with radiotherapy, and it is of great signi fi cance to study the resistance mechanism. This study aimed to analyze the expression of TNFAIP3 in the radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma, the difference between radiosensitivity and radioresistance, the relationship with the occurrence and development of radioresistance. Methods: Detection of TNFAIP3 mRNA expression was carried out by TNFAIP3 multi-point labeled DIG probe in situ hybridization. Results: In radiosensitivity and radioresistance of nasopharyngeal carcinoma, the moderately and strongly positive TNFAIP3 mRNA expression rates were 15% and 45%, (χ2=5.274, P=0.021 6), there were statistical significance. In the radioresistat nasopharyngeal carcinoma, TNFAIP3 mRNA moderately and strongly positive expression was positively correlated with TNM stage. In the degree of Ⅲ-Ⅳ tumor, it had moderately and strongly positive expression rate of 48.28%.In the degree of Ⅰ-Ⅱtumor, it had moderately and strongly positive expression rate of 36.36% (χ2=33.240, P＜0.005); The expression rates in distant metastasis and no distant metastasis were 81.81% and 31.03% (χ2=6.385, P=0.011 5), the difference had statistical signi fi cance. Conclusion: TNFAIP3 has antitumor effect, and it is correlated with the occurrence and development of radioresistant in nasopharyngeal carcinoma.

TNFAIP3 gene; Radiosensitivity; Radioresistance; Nasopharyngeal carcinoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.11.004

R739.31

A

1007-3639(2014)11-0820-04

2014-01-08

2014-10-14）

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No：11C1162)。

鄧香群 E-mail:hnsydxq@126.com