符德元 任傳利2 譚好升 魏金麗 祝玉祥 何春蘭 邵穩(wěn)喜 章佳新

1. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚州 225001 ；

2. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院臨床檢驗中心，江蘇 揚州 225001

乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA中Sox17基因甲基化檢測的臨床意義

符德元1任傳利2譚好升1魏金麗1祝玉祥1何春蘭1邵穩(wěn)喜1章佳新1

1. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚州 225001 ；

2. 江蘇省蘇北人民醫(yī)院臨床檢驗中心，江蘇 揚州 225001

背景與目的：在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，甲基化異常是導致抑癌基因失活的重要機制，是一種可用于腫瘤診斷及預后判斷、有價值的生物標志物。本研究旨在通過檢測乳腺癌組織及其相應的血漿循環(huán)DNA中Sox17基因的甲基化狀況，探討其在乳腺癌早期診斷和預后判斷方面的應用價值。方法：采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylation specific-PCR，MSP)法，對86例乳腺癌組織、36例乳腺良性腫瘤的癌旁正常組織及其配對的血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子甲基化進行檢測，并結合乳腺癌的主要臨床病理特性進行分析。結果：86例乳腺癌組織中Sox17基因啟動子的甲基化率為77.9%(67/86)，與其相應血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化率為61.6%(53/86)，36例癌旁正常乳腺組織及血漿中均未檢測到Sox17基因異常甲基化?；颊哐獫{循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化與腫瘤組織中該基因的甲基化顯著相關(r=0.502，P=0.000)。在乳腺癌組織標本中Sox17基因甲基化率與患者腫瘤分期(χ2=6.18，P=0.041)、淋巴結轉移(χ2=13.54，P=0.001)顯著相關，在血漿標本中，Sox17基因甲基化率與患者腫瘤分期(χ2=27.06，P=0.000)、腫瘤大小(χ2=9.65，P=0.007)及淋巴結轉移(χ2=20.80，P=0.000)顯著相關，與患者年齡、組織學分級及ER、PR、HER-2/neu等指標差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論：Sox17基因啟動子甲基化在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可能與乳腺癌的預后相關。血漿中Sox17基因甲基化，是一個有潛在應用價值的生物標志物。

乳腺癌；Sox17基因；DNA甲基化；循環(huán)DNA

癌基因突變和抑癌基因失活是腫瘤形成的兩大原因，而抑癌基因CpG島啟動子甲基化則是其功能失活的主要機制之一［1］。在乳腺癌形成及其侵襲性不斷增強的過程中，相關基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化起重要作用。許多在乳腺癌發(fā)病和進展方面起著重要作用的癌基因，都可能因為其啟動子區(qū)CpG島的甲基化而發(fā)生功能失活［2-3］。臨床上，相關基因的異常甲基化是一類有前途的生物標志物，特別是在患者的血清或血漿循環(huán)DNA中開展基因異常甲基化檢測的研究已受到眾多學者的重視［4］。我們先前的研究表明，在乳腺癌細胞株與組織標本中，Sox17基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化普遍存在，并且Sox17基因甲基化與乳腺癌的某些臨床病理特征顯著相關［5］。本研究擬通過進一步檢測乳腺癌腫瘤組織及其對應血漿循環(huán)DNA中Sox17基因甲基化狀況，分析它們之間的相互關系，結合臨床病理資料，探討Sox17基因甲基化在乳腺癌預后及診斷方面的應用價值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集江蘇省蘇北人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2009年10月—2010年10月86例乳腺癌手術切除標本，患者均為女性，年齡26～75歲，平均48.4歲。所有患者術前末接受化療、放療及其他抗癌治療。所有標本術后均經(jīng)病理科醫(yī)師確診。另收集同期36例乳腺良性腫瘤的癌旁正常乳腺組織及相應血漿標本作為對照(乳腺病16例，纖維腺瘤17例，乳腺脂肪瘤3例)?；颊呔鶠榕裕挲g18～62歲，平均43.2歲。研究獲得了倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

手術前1天收集所有患者外周靜脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中，室溫靜置30 min，以2 000×g離心速率10 min后將上層血漿部分吸至另一潔凈離心管中，再以2 000×g離心速率離心10 min，完全去除血細胞成分后置于干燥潔凈凍存管中，-80 ℃低溫冰箱保存。腫瘤組織標本于術中取材，放入液氮中速凍后存放于-80 ℃保存待檢。

1.2.2 組織標本DNA及血漿DNA抽提與純化及亞硫酸鹽處理

本研究采用DNeasy組織試劑盒(250)(德國QIAGEN公司)及QIAamp DNA Blood Mini Kit(250)(德國QIAGEN公司)試劑盒分別抽提腫瘤組織及血漿DNA，實驗步驟嚴格按說明書進行，提取的DNA用紫外分光光度計定量，確定濃度后-20 ℃保存。DNA的亞硫酸鹽處理采用EZ DNA Methylation-Gold試劑盒，具體步驟按操作說明進行，每次處理200～500 ng DNA。

1.2.3 甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測Sox17基因啟動子的甲基化狀況

PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Sox17甲基化上游引物為5’-GGAGATTCGCGTAGTTTTCG-3’，下游引物為5’-AACCCGACCATCACCGCG-3’，產(chǎn)物大小為198 bp；Sox17非甲基化上游引物為5’-GGAGATTTGTGTAGTTTTTG-3’，下游引物為5’-AACCCAACCATCACCACA-3’，產(chǎn)物大小為198 bp；MSP的反應體系為15 μL，包括經(jīng)亞硫酸鹽修飾的DNA模板2 μL，10×Buffer 1.5 μL (含Mg2+)，20 mmol/L的dNTPs 0.45 μL，20 nmol/L的上、下游引物各0.18 μL，HotStar Taq DNA聚合酶0.12 μL，用雙蒸水調整體系，使得終體積為15 μL。反應條件：95 ℃長變性15 min；然后94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)反應共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；反應結束后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)攝像保存。實驗過程中以SssⅠ甲基化酶處理的DNA作為甲基化的陽性對照，以經(jīng)全基因組擴增的健康成人外周血淋巴細胞DNA作為未甲基化的陰性對照。出現(xiàn)甲基化特異性引物擴增產(chǎn)物，為甲基化(M)；僅出現(xiàn)非甲基化特異性引物擴增產(chǎn)物，為非甲基化(U)。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析；采用 Fisher精確檢驗分析Sox17基因甲基化與乳腺癌主要臨床病理學特征之間的關系，采用Spearman相關分析方法對組織與匹配血漿標本中Sox17基因甲基化的相關性進行分析，所有檢驗均為雙側，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 組織及血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化情況

MSP法檢測結果顯示，86例乳腺癌組織中67例有Sox17基因甲基化(77.9%)，36例癌旁正常乳腺組織中無一例檢測到Sox17基因甲基化，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1A)。86例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA中，53例有Sox17基因甲基化(61.6%)，36例乳腺良性疾病患者相應血漿循環(huán)DNA中均未發(fā)現(xiàn)有Sox17基因甲基化(圖1B)。

圖 1 組織及血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化情況Fig. 1 Methylation status of Sox17 promoter in breast cancer tissues and corresponding Plasma circulating DNA

2.2 Sox17基因啟動子甲基化與臨床病理特征相關性分析

在乳腺癌組織標本中，Sox17甲基化與患者腫瘤分期(P=0.000)、淋巴結轉移(P=0.001)顯著相關。在乳腺癌血漿標本中，Sox17甲基化除與患者腫瘤分期(P=0.041)及淋巴結轉移相關外(P=0.000)，還與腫瘤大小顯著相關(P=0.007)；Sox17基因甲基化與患者年齡、組織學分級及ER、PR、HER-2/neu等指標間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

2.3 血漿與組織標本中Sox17基因甲基化的相關性分析

分析血漿循環(huán)DNA中Sox17基因甲基化與腫瘤組織中該基因的甲基化情況顯示兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.00，P=1.00，表2)；Spearman相關分析結果顯示，血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化與腫瘤組織的該基因的甲基化顯著相關(r=0.502，P=0.000，表3)。

表 1 腫瘤組織和對應血漿循環(huán)DNA中Sox17基因甲基化狀態(tài)與乳腺癌主要臨床病理特征之間的關系Tab. 1 Clinical characteristics of 86 patients with and without Sox17 methylation in tumor tissues or plasma circulating DNA [n(%)]

表 2 血漿與組織標本中Sox17基因甲基化比較Tab. 2 Analysis of Sox17 gene methylation in breast cancer tissues and corresponding plasma circulating DNA (χ2 test analysis)

表 3 血漿與組織標本中Sox17基因甲基化的相關性分析(Spearman correlation analysis)Tab. 3 Correlation analysis of Sox17 gene methylation in breast cancer tissues and corresponding plasma circulating DNA (Spearman correlation analysis )

3 討 論

近年來，雖然在乳腺癌診斷和輔助治療方面有了很大進展，但乳腺癌發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢，在大城市已占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。因此，臨床上進一步探索研究新的、有價值的診斷及預后標志物，對進一步提高我國乳腺癌的診治水平具有重要意義。研究表明，腫瘤相關基因啟動子甲基化所導致的基因沉默是人類的癌癥的共同特點，是腫瘤抑制基因功能喪失的一個重要機制［1］。許多在乳腺癌發(fā)病和進展方面起著重要作用的癌基因［2-3］，都可能因為其啟動子區(qū)CpG島的甲基化而發(fā)生功能失活。研究表明，DNA異常甲基化發(fā)生在腫瘤早期，在正常組織則很少出現(xiàn)，而且甲基化通常發(fā)生在基因的特定區(qū)域，較為單一，易于被臨床檢測，同時隨著技術的不斷完善發(fā)展，使得臨床上能夠對微量樣本進行甲基化檢測，因此，基因異常甲基化是一種被認為有臨床應用前景的生物標志，其在腫瘤臨床診斷、預后判斷及療效預測等方面的巨大潛力已開始得到重視。

Sox17定位于8qll.23，是Sox基因家族一員，作為轉錄因子參與多種生物細胞發(fā)育過程和生物活性，其在神經(jīng)少突膠質細胞發(fā)展［6］、血管生成［7］、胚胎內胚層形成［8］及干細胞分化調控等方面具有重要功能［9］，在癌變過程中，Sox17基因同樣發(fā)揮重要作用，在不同組織來源的腫瘤中，Sox17基因均可因其啟動子區(qū)CpG島甲基化而導致其表達減低［10-12］，從而喪失其抑癌基因的功能，促進癌變發(fā)生。在先前的研究中，我們通過系統(tǒng)分析Sox17基因在乳腺癌細胞株和組織標本中的表達和甲基化情況，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞和大部分乳腺癌組織中，Sox17基因的mRNA表達水平顯著降低，而且Sox17表達水平與其啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)密切相關。在74.3%的乳腺癌組織中，Sox17基因表現(xiàn)為甲基化狀態(tài)，且Sox17基因甲基化與乳腺癌分期及淋巴結轉移顯著相關［5］。本研究中，86例乳腺癌組織中，67例(77.9%)發(fā)生Sox17基因甲基化，而在36例癌旁正常乳腺組織中卻無此現(xiàn)象，證明Sox17基因甲基化與患者腫瘤分期(P=0.000)、淋巴結轉移(P=0.001)顯著相關，表明在人乳腺癌中DNA甲基化是抑制乳腺癌細胞Sox17基因表達的主要機制，甲基化導致的Sox17基因表達沉默不僅是一個經(jīng)常發(fā)生的事件，而且對乳腺癌的預后判斷具有重要意義。

研究表明，惡性實體腫瘤可以釋放大量的基因組DNA進入人體循環(huán)，而且這些循環(huán)DNA可以獲得腫瘤細胞本身所具有的所有生物特性［13］。更為重要的是，這些腫瘤細胞特異性的循環(huán)DNA不僅僅限于轉移癌患者，在腫瘤早期或腫瘤仍局限于原發(fā)臟器時，它即可出現(xiàn)在患者的血清和(或)血漿中［14］。已有研究表明，乳腺癌患者的血漿循環(huán)DNA濃度異常增高［15-16］。血漿循環(huán)DNA和原發(fā)性乳腺癌腫瘤標本中存在較為一致的表觀遺傳學改變，表明這些腫瘤表觀遺傳標志物在乳腺癌的監(jiān)測中具有潛在價值［17-19］，在乳腺癌患者的血清或血漿循環(huán)DNA中檢測相關基因異常DNA的研究已被眾多學者廣泛探討。因此，檢測血清或血漿中存在的循環(huán)DNA的各種生物學特性可用于腫瘤患者的無創(chuàng)性診斷。

本研究中，在86例乳腺癌患者血漿循環(huán)DNA中，53例(61.6%)出現(xiàn)了Sox17基因甲基化，在36例乳腺良性疾病患者中則無Sox17基因甲基化發(fā)生。Spearman相關分析表明，血漿循環(huán)DNA中Sox17基因啟動子的甲基化與腫瘤組織的該基因的甲基化狀況顯著相關(r=0.502，P=0.000)，提示其外周血標本可作為腫瘤標志物診斷乳腺癌。此外，血漿循環(huán)DNA中Sox17甲基化除與患者腫瘤分期(P=0.041)及淋巴結轉移相關外(P=0.000)，還與腫瘤大小顯著相關(P=0.007)，與其在乳腺癌組織中的結果也具有高度的一致性。另外，血漿取材方便，創(chuàng)傷性小，可反復取材，且患者易于接受。因此，檢測血漿循環(huán)DNA中Sox17基因的甲基化可用于乳腺癌早期診斷。

綜上所述，本研究結果顯示，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，Sox17基因甲基化是一個頻繁發(fā)生的事件，在乳腺癌組織及血漿中具有高度一致性和特異性，是一個有潛在應用價值的生物標志物。因此，Sox17基因甲基化的研究對于進一步明確乳腺癌的發(fā)病機制、早期診斷和預后具有重要的臨床意義。

［1］ JONES P A, BAYLIN S B. The epigenomics of cancer ［J］. Cell, 2007, 128(4): 683-692.

［2］ SZYF M, PAKNESHAN P, RABBANI S A. DNA methylation and breast cancer ［J］. Biochem Pharmacol, 2004, 68(6): 1187-1197.

［3］ AGRAWAL A, MURPHY R F, AGRAWAL D K. DNA methylation in breast and colorectal cancers ［J］. Mod Pathol, 2007, 20(7): 711-721.

［4］ WIDSCHWENDTER M, MENON U. Circulating methylated DNA: a new generation of tumor markers ［J］. Clin Cancer Res, 2006, 12(24): 7205-7208.

［5］ FU D Y, WANG Z M, LI-CHEN, et al. Sox17, the canonical Wnt antagonist, is epigenetically inactivated by promoter methylation in human breast cancer ［J］. Breast Cancer Res Treat, 2010, 119(3): 601-612.

［6］ SOHN J, NATALE J, CHEW L J, et al. Identification of Sox17 as a transcription factor that regulates oligodendrocyte development ［J］. J Neurosci, 2006, 26(38): 9722-9735.

［7］ MATSUI T, KANAI-AZUMA M, HARA K, et al. Redundant roles of Sox17 and Sox18 in postnatal angiogenesis in mice［J］. J Cell Sci, 2006, 119(17): 3513-3526.

［8］ SHIMODA M, KANAI-AZUMA M, HARA K, et al. Sox17 plays a substantial role in late-stage differentiation of the extraembryonic endoderm in vitro ［J］. J Cell Sci, 2007, 120(21): 3859-3869.

［9］ KIM I, SAUNDERS T L, MORRISON S J. Sox17 dependence distinguishes the transcriptional regulation of fetal from adult hematopoietic stem cells ［J］. Cell, 2007, 130(3): 470-483.

［10］ ZHANG W, GL?CKNER S C, GUO M, et al. Epigenetic inactivation of the canonical Wnt antagonist SRY-box containing gene 17 in colorectal cancer ［J］. Cancer Res, 2008, 68(8): 2764-2772.

［11］ KUO I Y, WU C C, CHANG J M, et al. Low SOX17 expression is a prognostic factor and drives transcriptional dysregulation and esophageal cancer progression ［J］. Int J Cancer, 2014, 135(3): 563-573.

［12］ OISHI Y, WATANABE Y, YOSHIDA Y, et al. Hypermethylation of Sox17 gene is useful as a molecular diagnostic application in early gastric cancer ［J］. Tumour Biol, 2012, 33(2): 383-393.

［13］ GARCIA J M, SILVA J M, DOMINGUEZ G, et al. Heterogeneous tumor clones as an explanation of discordance between plasma DNA and tumor DNA alterations ［J］. Genes Chromosomes Cancer, 2001, 31(3):300-301.

［14］ SILVA J M, DOMINGUEZ G, GARCIA J M, et al. Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlations ［J］. Cancer Res, 1999, 59(13): 3251-3256.

［15］ SILVA J M, SILVA J, SANCHEZ A, et al. Tumor DNA in plasma at diagnosis of breast cancer patients is a valuable predictor of disease-free survival ［J］. Clin Cancer Res, 2002, 8(12): 3761-3766.

［16］ HUANG Z H, LI L H, HUA D. Quantitative analysis of plasma circulating DNA at diagnosis and during follow-up of breast cancer patients ［J］. Cancer Lett, 2006, 243(1): 64-70.

［17］ MüLLER HM, WIDSCHWENDTER A, FIEGL H, et al. DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker ［J］. Cancer Res, 2003, 63(22): 7641-7645.

［18］ SHARMA G, MIRZA S, PARSHAD R, et al. DNA methylation of circulating DNA: a marker for monitoring efficacy of neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients ［J］. Tumour Biol, 2012, 33(6): 1837-1843.

［19］ HOQUE M O, FENG Q, TOURE P, et al. Detection of aberrant methylation of four genes in plasma DNA for the detection of breast cancer ［J］. J Clin Oncol, 2006, 24(26): 4262-4269.

Clinical signi fi cance of Sox17 gene promoter methylation in plasma circulating DNA in breast cancer patients

FU De-yuan1, REN Chuan-li2, TAN Hao-sheng1, WEI Jin-li1, ZHU Yu-xiang1, HE Chun-lan1, SHAO Wen-xi1, ZHANG Jia-xin1(1.Department of Thyroid and Breast Surgery, Subei People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou Jiangsu 225001, China; 2.Medical Laboratory, People’s Hospital of Jiangsu Province, Yangzhou Jiangsu 225001, China)

FU De-yuan E-mail: fdy1003@163.com

Background and purpose: Aberrant DNA methylation that leads to the inactivation of tumor suppressor genes plays important roles in development and progression of breast cancer. Clinically, related gene methylation is considered to be a promising biomarker for tumor diagnosis and prognosis. This study aimed to investigate the methylation status of Sox17 gene in breast cancer tissue and its corresponding plasma circulating DNA, as well as to investigate its value in breast cancer early diagnosis and prognosis. Methods: The Sox17 gene promoter methylation status was detected by MSP in 86 cases of breast cancer, 36 normal breast tissues and its paired plasma DNA, the results were analyzed with corresponding clinical and pathological features. Results: The frequency of Sox17 gene methylation rate among 86 breast cancer tissues was 77.9%(67/86), and was 61.6%(53/86)in plasma circulating DNA, however, no Sox17 gene methylation was found in normal breast tissues. Sox17 gene promoter methylation in plasma circulating DNA was signi fi cantly associated with the methylation status in tumor tissues (r=0.502, P=0.000). In breast cancer tissue specimens, Sox17 methylation status was significantly correlated with tumor stage (χ2=6.18,P=0.041) and lymph node metastasis (χ2=13.54, P=0.001); Sox17 gene methylation rate was signi fi cantly correlated with tumor stage (χ2=27.06, P=0.000), tumor size (χ2=9.65, P=0.007) and lymph node metastasis (χ2=20.80, P=0.000) in plasma samples, and there was no signi fi cant difference of Sox17 gene methylation between patient age, histological grade and ER, PR, HER-2/neu status. Conclusion: Sox17 gene promoter methylation plays an important role in the carcinogenesis and development of breast cancer, and may be associated with the prognosis of breast cancer. Furthermore, methylated Sox17 gene may be a useful tumor biomarker in plasma circulating DNA for breast cancer detection and disease monitoring.

Breast cancer; Sox17 gene; DNA methylation; Plasma circulating DNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.11.002

R737.9

A

1007-3639(2014)11-0808-06

2014-06-09

2014-09-21）

國家自然科學基金資助項目(No：81172508)。

符德元 E-mail:fdy1003@163.com