李 芬，胡 濤，謝汝婷，劉 偉，程天印,李 娜

（1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ，長沙 410128；2. 湖南農業(yè)大學園藝園林學院，長沙 410128）

·簡報·

利用正交設計優(yōu)化羊食道口線蟲SRAP-PCR反應體系

李 芬1，胡 濤1，謝汝婷1，劉 偉1，程天印1,李 娜2

（1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ，長沙 410128；2. 湖南農業(yè)大學園藝園林學院，長沙 410128）

本研究利用正交設計L16（4）對羊食道口線蟲SRAP-PCR反應體系的4因素：Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物進行摸索。結果表明：各因素的不同水平對SRAP-PCR反應結果都有顯著的影響，正交設計組合4中擴增的條帶最清晰；羊食道口線蟲SRAP-PCR最佳反應條件：最佳引物給合為Me1/Em7，最佳反應體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR buffer、20 ng模板DNA、Mg2+（25 mmol/L）3 μL、dNTPs （2.5 mmol/L/μL）3 μL、引物（10 pmol/μL）4μL、rTaq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL、滅菌ddH20補足。本研究結果為進一步采用SRAP技術來研究食道口線蟲遺傳進化奠定了堅實基礎。

羊；食道口線蟲；SRAP；正交設計

食道口線蟲病是由圓形目（Strongyloidea）食道口屬（Oesophagostomum）的食道口線蟲寄生于家畜的大腸中所引起的，因在大腸壁上形成淡黃色的結節(jié)又稱結節(jié)蟲病[1]。引起羊食道口線蟲病的食道口線蟲有哥倫比亞食道口線蟲、微管食道口線蟲、粗紋食道口線蟲和甘肅食道口線蟲。傳統(tǒng)寄生蟲分類依靠寄生蟲的形態(tài)、生活史、寄生的宿主等特征進行描述，但是對形態(tài)相似的蟲種、株的鑒定很困難，且寄生蟲蟲株的遺傳進化分析依靠傳統(tǒng)的方法很難解決。分子生物學技術的發(fā)展，為食道口線蟲蟲株之間或者與其他寄生蟲之間的鑒定提供了新思路。有報道采用PCR-SSCP、PCR-RFLP方法擴增ITS序列對食道口線蟲進行分子遺傳標記[1,2]。但是，PCR-RFLP方法建立在已知物種序列的基礎上，對未知物種序列的檢測效果不佳；PCR-SSCP方法對150～300 bp的核酸序列檢出率最高，而對序列是否有突變還需要經過測序檢測。

SRAP (sequence-related amplified polymorphism，即相關序列擴增多態(tài)性）是由Li和Quiros[3]創(chuàng)建的一種基于PCR的新型DNA分子標記技術，通過獨特的引物擴增基因組內的開放閱讀框（open reading frames，ORFs），SRAP標記的正、反引物分別與基因外顯子里GC 含量、啟動子和內含子里AT 含量豐富的區(qū)域配對而使基因呈現(xiàn)多態(tài)性[4-9]。此技術具有操作簡便迅速、成本低、重復性高、高穩(wěn)定性等特點，適合進行基因定位、克隆、遺傳圖譜構建及遺傳多樣性分析等研究，目前SRAP技術已被用于荷花等多種植物[8,9]、草魚[10]、異尖線蟲[11]、肝片吸蟲[12,13]、日本血吸蟲[14]等遺傳圖譜的構建和遺傳多樣性分析。作為遺傳標記SRAP在寄生蟲研究中應用很少，主要見于吸蟲的報道[12-14]，是否適用于線蟲的研究報道僅見會議摘要[11]。在SRAP中PCR的反應體系很重要，它受很多因素的影響，為此何正文等[15]提出了采用正交設計來進行PCR反應體系的優(yōu)化。本文通過正交實驗設計，針對rTaq酶、Mg2+、dNTPs、引物這4個PCR反應因素進行SRAP-PCR反應體系優(yōu)化，來研究SRAP技術是否適合于食道口線蟲遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品的采集及處理食道口線蟲采樣于屠宰場屠宰的1頭山羊結腸內。生理鹽水洗凈后，逐級過30%、50%、70%的酒精，最后于70%的酒精4℃保存。

1.2 主要試劑及儀器WizardTMDNA Clean-Up System為Promega公司產品；ExTaq酶、PCR試劑、DNA Marker DL2000為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產品；蛋白酶K 為天根公司產品； Dolophin-Doe凝膠成像系統(tǒng)；Gene Amp PCR System 9700型PCR儀；DYY—Ⅲ型電泳儀。

1.3 蟲體DNA的提取取出70%酒精保存的蟲體，用純凈水反復吹打沖洗6次后，置于1.5 mL Eppendorf管中，用滅菌且經紫外燈照射過的眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入250 μL GT buffer反復研磨，再加入20 μL蛋白酶K，混勻后，55℃培養(yǎng)箱中16～18 h，其間搖動數(shù)次，使蟲體組織充分裂解。將消化好的蟲體懸液按WizardTMDNA Clean-Up System使用說明進行蟲體DNA提取，將提取出的DNA樣品濃度稀釋至20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SRAP反應體系優(yōu)化

1.4.1 引物 根據(jù)Li 等[3]報道，SRAP-PCR體系中引物有以下組合（見表1），引物由金思瑞生物科技有限公司合成。

1.4.2 正交體系設計表格 按照表2采用L16（4 ）正交試驗設計，制備總體積25 μL的PCR反應體系，除表中變化因素外，每個組合中還含有2.5 μL 10×PCR buffer和20 ng模板DNA，3次重復實驗，取2 μL擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。SRAP-PCR的擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，35℃ 退火1 min，72℃延伸60 s，5個循環(huán)；94℃變性30 s，50℃退火1min，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；循環(huán)結束后，72℃延伸7 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與討論

2.1 引物篩選結果按照擴增要求（條數(shù)清晰，帶數(shù)多，多態(tài)性好），通過篩選引物選用Me1/Em7組合作為本次試驗的引物。

2.2 正交實驗擴增結果按照正交試驗設計PCR擴增結果見圖1。從圖1中可見：體系1、4擴增的條帶清晰，背景清晰；體系2、3、6、13擴增的背景淺，且條帶無或者是只有1～2條，不可以采用；體系8、9、10、14、15擴增的條帶多，背景深，但是擴增的條帶沒有體系1、4的清晰；體系11、12擴增的條帶多，背景淺，也存在著條帶不清晰的現(xiàn)象；體系16擴增的背景深，條帶不清晰。

表1 SRAP引物Table 1 SRAP primers

表2 SRAP-PCR正交實驗設計反應體系L16（44）Table 2 SRAP-PCR orthogonal experimental design L16（44）

2.3 rTaq酶對PCR擴增的影響如圖1所示，體系7與體系4比較，引物濃度與dNTPs濃度一樣，rTaq酶濃度增加，Mg2+濃度減少，擴增的條帶在減少且背景不清晰；體系8到體系11之間的變化也是一樣的規(guī)律；體系5與1比較，兩者Mg2+濃度一樣，rTaq酶濃度與引物濃度增加，體系1的條帶比體系5的清晰且明顯；體系3與7的變化規(guī)律也是一樣。說明酶的濃度影響了擴增基因條帶的清晰度。

2.4 Mg2+對PCR擴增的影響圖1顯示，隨著Mg2+濃度的變化，各體系擴增的結果不一，按照擴增條帶清晰且背景清晰的選擇條件，應當選擇Mg2+濃度為3時的體系4與8組合，這兩個體系組合能把250～1000 bp段之間的條帶分開。Mg2+為3 μL時，體系4中的條帶清晰且背景清晰。隨著rTaq酶濃度與dNTPs濃度的增加，擴增的條帶并沒有增加而是有所減少，且背景變淺（體系8和12）。

圖1 正交組合電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of orthogonal combinationM: DNA分子量標準（DL2000）；1～16: 擴增體系組合1-16M: DNA Marker(DL2000)；1-16: PCR amplifi cation system1-16

2.5 引物濃度對PCR擴增的影響如圖1所示，擴增體系1～4 rTaq酶濃度一樣，引物為4 μL（10 pmol/ μL）時擴增的條帶數(shù)多且背景清晰，擴增體系5～8有相同的變化規(guī)律，說明引物濃度影響擴增結果。體系4與8比較，兩者的Mg2+濃度一樣，引物濃度減少，擴增的基因條帶數(shù)存在1～2個差異，擴增的背景變得不是很清晰，且條帶變的很小。圖1中的體系10與14的變化與此相同，說明基因擴增的條帶與引物濃度變化有關系。

通過正交試驗篩選得到擴增食道口線蟲的最終的SRAP-PCR反應條件：2.5 μL10×PCR buffer、20 ng模板DNA、Mg2+（25 mmol/L）3 μL、dNTPs（2.5 mmol/μL）3 μL、引物（10 pmol/μL）4 μL、rTaq DNA（5 U/μL）聚合酶0.2 μL，總體積25 μL。

通過正交設計SRAP-PCR反應體系，可以更全面的考慮各因素及其之間的交互作用，降低了試驗成本，這也與其他報道相同[17]。SRAP技術在寄生線蟲研究中的應用目前在國內還沒有相關實驗性文章報道。本研究將不同的因素和水平進行比較分析，確定了一個優(yōu)化的反應體系，應用該體系在食道口線蟲DNA研究中可獲得清晰穩(wěn)定的擴增結果。因此，SRAP標記技術有望在食道口線蟲的遺傳多頭性的研究中得到廣泛應用，并為其他寄生蟲類的基因組分析奠定基礎。

[1] 林瑞慶, 張媛, 朱興全. 食道口線蟲與食道口線蟲病的研究進展[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2010, 32(9): 737-740.

[2] 胡冰. 粗紋食道口線蟲和哥倫比亞食道口線蟲遺傳多樣性和分子分類研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2013.

[3] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging iniBrassica[J]. Theor Appl Genet, 2001, 103: 455-103.

[4] Li G, Gao M, Yang B, et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theor Appl Genet, 2003, 107: 168-107.

[5] 李巧燕, 林瑞慶, 朱興全. SRAP分子標記及其應用概述.熱帶醫(yī)學雜志[J]. 2006, 6(4): 467-469, 478.

[6] 任羽, 王得元, 張銀東. 相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）:一種新的分子標記技術[J]. 中國農學通報, 2004, 20(6): 11-14.

[7] 柳李旺, 龔義勤, 黃浩, 等. 新型分子標記--SRAP與TRAP及其應用[J]. 遺傳, 2004, (5): 777-781.

[8] Jehan T, Vashishtha A,Yadav S R, et al. Genetic diversity and genetic relationships in Hyacinthaceae in India usingRAPD and SRAP markers[J]. Physiol Mol Biol Plants, 2014, 20(1):103-114.

[9] Deng C L, Qin R Y, Gao J, et al. SRAP analysis of DNA base sequence changes in lotus mutants induced by Fe+ implantation[J]. Genet Mol Res, 2013, 12(1): 335-343.

[10] 張志偉, 韓曜平, 仲霞銘, 等. 草魚野生群體和人工繁殖群體遺傳結構的比較研究[J]. 中國水產科學, 2007, 9: 720-725.

[11] 李巧燕, 林瑞慶, 宋慧群, 等. SRAP技術應用于異尖線蟲的初步研究[C] //中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第九次學術研討會論文摘要集, 2006: 234.

[12] Alasaad S, Li Q Y, Lin R Q, et al. Genetic variability among Fasciola hepatica samples from different host species and geographical localities in Spain revealed by the novel SRAP marker[J]. Parasitol Res, 2008, 103(1): 181-186.

[13] Li Q Y, Dong S J, Zhang W Y, et al . Sequence-related amplified polymorphism, an effective molecular approach for studying genetic variation in Fasciola spp. of human and animal health significance[J]. Electrophoresis, 2009, 30(2): 403-409.

[14] Song H Q, Mo X H, Zhao G H, et al. Electrophoretic detection of genetic variability among Schistosoma japonicum isolates by sequence-related amplified polymorphism[J]. Electrophoresis, 2011, 32(11): 1364-1370.

[15] 何正文, 劉運生, 陳立華, 等. 正交設計直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]. 湖南醫(yī)科大學學報, 1998, 23(4): 403-404.

[16] 張平湖, 劉冠明, 橄欖SRAP-PCR體系的建立和優(yōu)化[J].中國農學通報, 2010, 26(15): 86-88.

OPTIMIZATION OF SRAP-PCR REACTION SYSTEM FOR OESOPHAGOSTOMUM OF GOAT USING ORTHOGONAL DESIGN

LI Fen1, HU Tao1, XIE Ru-ting1, LIU Wei1, CHENG Tian-yin1, LI Na2
( 1.College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to know the genetic diversity of Oesophagostomum of goat using SRAP-PCR, four factors, including DNA polymerase, Mg2+, dNTPs and primers in SRAP-PCR system were optimized using orthogonal design. The result should 25 μL optimized SRAP-PCR system contains 2.5 μL 10×PCR buffer, 20 ng DNA template, 3 μL 25 mmol/L Mg2+, 3 μL 2.5 mmol/L dNTPs, 4 μL 10 pmol/μL primers, 0.2 μL rTaq DNA polymerase (5U/μL) and dd H2O. The results built a base for the study of genetic evolution of Oesophagostomum using SRAP technology.

Goat; Oesophagostomum; SRAP; orthogonal design

S852.731

B

1674-6422（2014）04-0067-05

2014-02-25

國家自然科學基金項目（31000901）；湖南省教育廳科學研究優(yōu)秀青年項目（141392）

李芬，女，博士研究生，講師，主要從事分子寄生蟲學研究

程天印，E-mail：hn5368@163.com；李娜，E-mail：1112lina@163.com