王喜軍，堵 芳，馬 君，王 挺，盛曉楓，劉 毅，劉 偉

（1.湖南省長沙市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，長沙 410013；2.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128）

·簡報·

長沙市野生態(tài)動物園斑馬蜱pcox1基因擴增及序列分析

王喜軍1,2，堵 芳1，馬 君1，王 挺1，盛曉楓1，劉 毅1，劉 偉1

（1.湖南省長沙市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，長沙 410013；2.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128）

為研究長沙市生態(tài)動物園引進的非洲肯尼亞斑馬蜱的線粒體DNA的部分細胞色素C氧化酶第Ⅰ亞基（cytochrome coxidase subunit l，pcox1）基因序列的遺傳變異情況，本研究對其線粒體pcox1基因序列進行PCR擴增，并使用DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67進行分析。結果顯示，幾種斑馬蜱為消色牛蜱、麗色扇頭蜱和璃眼蜱屬，種間差異為0.7%～20.2%，種內相似度較高，表明pcox1基因可作為蜱種間遺傳變異研究的標記，研究結果為蜱的分類鑒定以及進一步的分子流行病學調查奠定了基礎。

斑馬；蜱；pcox1；序列分析

蜱屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）、蛛形綱（Arachnida）、蜱螨亞綱（Acari）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea），為專性體外吸血的節(jié)肢動物，是一類陸生脊椎動物非永久性體外寄生蟲，在昆蟲學、寄生蟲學、醫(yī)學上具有重要的地位[1]。據統(tǒng)計，全世界蜱總共約899種，其中約有700多種屬于硬蜱科，約150種為軟蜱[2]。蜱以吸食血液為生，除卵外，每個發(fā)育時期的進一步發(fā)育都必須先吸飽血[3]。蜱在自然界廣泛分布于各類森林、草原、農田和灌叢，種群數(shù)量取決于宿主的數(shù)量及生態(tài)環(huán)境條件[4]。蜱是許多人畜共患疾病的病原體傳播媒介和宿主。蜱所攜帶的病原體不僅能夠傳播疾病，多數(shù)情況下還能經卵遺傳給后代。同時，蜱在動物界普遍寄生，經常更換宿主。因此，蜱可以在許多動物中傳染疾病，并將野生動物或家畜體內的病原體經血、淋巴道傳染給人類[5]。在所有能夠傳染疾病的媒介生物類型中，蜱傳播疾病的能力僅次于蚊類[6]。

目前已報道我國的蜱可傳播14種細菌、32種原蟲、126種病毒、18種螺旋體、18種立克次體和一些支原體、衣原體，并分泌毒素[7]。世界上約10%的蜱攜帶病原體，被這種蜱叮咬后，在特定環(huán)境下將引起人、動物疾病和地方性人畜共患病（如出血熱、萊姆病、無形體病、森林腦炎、蜱媒斑疹熱、Q熱、巴貝西蟲病、豬瘟及蜱癱等）。國內外已有幾例蜱傳播疾病感染導致神經損害的病例[8]。2010年我國河南省商城縣爆發(fā)多起蜱叮咬人致死事件，引起人們對蜱的廣泛關注，深入研究蜱的基因序列對控制和消滅蜱傳播的多種疾病具有重要的意義。

線粒體DNA部分細胞色素C氧化酶第Ⅰ亞基（cytochrome c oxidase subunit 1，pcox1）基因是核基因組以外的線粒體基因組基因，不帶重組遺傳，因而每一個序列都是一個單模標本[9]。pcox1以母系遺傳為主，進化速度快，無雙親遺傳的遺傳差異，且不受基因重組、易位等畸變影響，也無核基因中那種功能不清的片段。與核基因相比，線粒體基因的進化方式相對簡捷，是研究分子進化的有價值的基因[10]。本研究通過對斑馬蜱線粒體DNA pcox1進行序列分析，為種群遺傳變異及進一步分子遺傳學和診斷學提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品樣品采自于長沙市生態(tài)動物園2010年7月從非洲肯尼亞引進的斑馬（表1），各蜱樣品外觀形態(tài)見圖1。

表1 本研究中蜱樣品代碼Table 1 Sample code of ticks in this study

圖1 蜱樣品外觀形態(tài)Fig.1 The ventral and dorsal view of ticks

A: 消色牛蜱(BMP2); B: 麗色扇頭蜱(BMP5); C: 麗色扇頭蜱(BMP6); D: 璃眼蜱(BMP8)

A: Boophilus decoloratus (BMP2); B: Rhipicephalus pulchellu (BMP5); C: Rhipicephalus pulchellu (BMP6); D: Hyalomma(BMP8)

1.2 主要試劑WizardTM DNA Clean-Up System為Promega公司產品；Ex Taq酶、PCR試劑、DNA

Marker DL 2000為TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司產品；蛋白酶K為Merck公司產品。

1.3 方法

1.3.1 蟲體DNA的提取 取滅菌且經過紫外燈照射過的眼科剪將蜱組織剪碎，加入Nucleic Lysis Solution裂解緩沖液200 μL，混勻；然后加入30 μL蛋白酶K (50 μg/μL)，對于飽血蜱蟲蛋白酶K使用量加倍，可達50 μL；蓋緊蓋子于震蕩儀上混勻， 56℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，其間數(shù)次不定時的搖動，使蜱組織與裂解液、蛋白酶K充分接觸并裂解。消化好的蟲體懸液按Genomic DNA mini kit使用說明提取蟲體DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增 采用Chitimia等[11]報道的引物：pcox1F: 5′-GGAACAATATATTTAATTTTTG-3′(23bp)，pcox1R: 5′-ATCTATCCCTACTGT AAATATATG-3′（24bp）。引物由上海生工生物技術有限公司進行合成。擴增體系為25 μL：滅菌水l4.25 μL、10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL、MgC12（25 mmol/L）4 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物（100 pmol/L）0.5 μL、下游引物（100 pmol/L）0.5 μL、Taqpolymerase（5 U/L）0.25 μL、DNA模板l μL。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.3.3 pcox1序列測定及其在種系發(fā)育分析中的應用 將純化后的PCR產物送華大基因生物有限公司測序，測序結果用DNAStar 5.0軟件進行分析。從GenBankTM檢索代表性的蜱pcox1序列，然后與之進行相似性比對和蜱種系發(fā)育分析，以豬蛔蟲WQ為外群。利用Clustalx2.0及Phylip3.67軟件對獲得蜱pcox1序列進行比對及計算遺傳距離。采用Mega 4.1程序中的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與討論

2.1 PCR擴增結果4個樣品均成功地擴增出約800 bp的片段，與預期pcox1目的片段長度相符（圖2）且無非特異性條帶。

圖2 斑馬蜱pcox1基因PCR擴增結果Fig. 2 Amplifi cation of pcox1 of ticks from zebra by PCRM：DNA分子量標準（DL2000）；1～4：BMP2、BMP5、BMP6、BMP8；5：陰性對照M: DNA Marker(DL2000)；1-4: BMP2, BMP5, BMP6, BMP8; 5: Negative control

2.2 基因序列測定結果及同源分析根據測序結果，蜱pcox1序列總長為732 bp。通過DNAStar（V5.01）、Clustalx2.0及Phylip3.67軟件分析，各樣品的pcox1種間差異明顯，雖然，也存在種內差異，但大部分種內相似度很高，麗色扇頭蜱BMP5與BMP6之間相似度為99%（圖3）。用軟件PAUP構建的MP系統(tǒng)進化樹顯示，消色牛蜱BMP2、麗色扇頭蜱BMP5和BMP6、璃眼蜱BMP8的相似性高，其中BMP5與BMP6處于同一分支上，而與豬蛔蟲相隔較遠，這一結果與序列分析結果具有一致性（圖4）。本研究首次報道了消色牛蜱和麗色扇頭蜱pcox1序列。

圖3 蜱pcox1基因序列差異性比較Fig. 3 Comparison of pcox1 sequence of ticks

圖4 pcox1基因序列以臨接法構建的進化樹Fig. 4 Phylogenic tree construction based pcox1 gene using Neighbour Joining (NJ)

參考文獻

[1] 楊曉軍, 陳澤, 劉敬澤. 蜱類的起源和演化[J]. 昆蟲知識, 2008, 45(1): 28-33.

[2] 徐廣, 方慶權, Keirans J E, 等. 分子系統(tǒng)進化關系分析的一種新方法-貝葉斯法在硬蜱屬中的應用[J]. 動物學報, 2009, 49(3): 380-388.

[3] 李鷗, 王連想, 向振強. 分子遺傳標記與動物分子育種研究進展[J]. 廣東農業(yè)科學, 2010, 11: 210- 212.

[4] 程天印, 周金林. 蜱源抗凝分子及其作用機制[J]. 湖南農業(yè)大學學報(自然科學版), 2004, 30(6): 583-587.

[5] 郝雪峰, 殷宏, 羅建勛. 蜱的化學和免疫學防止研究進展[J]. 動物醫(yī)學進展, 2008, 29(12): 52-56.

[6] 龔海燕, 周金林, 周勇志, 等. 鐮形扇頭蜱—新基因的分離、克隆、表達和抗蜱免疫保護作用[J]. 中國獸醫(yī)寄生蟲病, 2005, 13(3): 1-5.

[7] 寶福凱. 蜱傳病原體的混合感染研究進展[J]. 中國熱帶醫(yī)學, 2007, 7(l): 112-114.

[8] 龔海燕, 周金林. 蜱對宿主免疫調節(jié)作用的研究進展[J].動物醫(yī)學進展, 2005, 26(4): 34-38.

[9] Avise J C. Moleuclar population structure and the biogeographick history of a regional founa: a case history with lessons for conservation biology[J]. Oikos, 1992, 63: 62-76.

[10] 張亞平. 從DNA序列到物種樹[J]. 動物學研究, 1996, 17(3): 247-252.

[11] Chitimia L, Lin R Q, Osoroaba I, et al. Genetic characterization of ticks from southwestern Romania by sequences of mitochondrial cox1 and nad5 gene [J]. Exp Appl Acarol, 2010, 52(3): 305-311.

GENE MANIPULATION AND SEQUENCE ANALYSIS OF PCOX1 OF TICKS FROM A ZEBRA IN CHANGSHA ZOO

WANG Xi-jun1,2DU Fang1, MA Jun1, WANG Ting1, SHENG Xiao-feng1, LIU Yi1, LIU Wei1
(1. Hunan Animal Health Supervision Institute, Changsha 410013, China; 2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to illustrate sequence variation in cytochrome c oxidase subunit l (pcox1) mtDNA of ticks collected from a Kenya zebra in Changsha Ecological Zoo, pcox1 mtDNA are amplified and analyzed using softwares DNAStar (V5.01), Clustalx2.0 and Phylip3.67. The ticks collected from a zebra were Boophilus decoloratus, Rhipicephalus pulchellu and Hyalomma with inter-species difference at 0.7%-20.2%. The pcox1 gene might be used as a marker for genetic variability.

Zebra; tick; pcox1; sequence analysis

S852.746

B

：1674-6422（2014）04-0063-04

2013-06-18

湖南省教育廳一般項目（11C0669）；湖南省畜牧水產局一般項目；湖南農業(yè)大學生創(chuàng)新項目（DFCXY201231）；國家自然基金項目（30771616）

王喜軍，女，碩士研究生，獸醫(yī)學專業(yè)

劉偉，E-mail：weiliupro@163.com