楊越明 金法祥 鐘建平

泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌與耐藥相關(guān)基因檢測及親緣性分析

楊越明 金法祥 鐘建平

目的了解泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌（PDR-ABA）的菌株親緣性。方法 對(duì)20株P(guān)DR-ABA進(jìn)行3種耐藥相關(guān)看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉(zhuǎn)移獲得的與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件的遺傳標(biāo)記檢測。結(jié)果 20株P(guān)DR-ABA中檢出4種β-內(nèi)酰胺類獲得性耐藥基因，5種氨基糖苷類獲得性耐藥基因，2種獲得性抗菌制劑外排泵基因和5種可移動(dòng)遺傳元件。耐藥相關(guān)看家基因carO、gyrA、parC均存在有義突變。 結(jié)論 PDR-ABA存在5個(gè)克隆傳播，其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號(hào)菌株呈流行趨勢。

鮑氏不動(dòng)桿菌 看家基因 水平轉(zhuǎn)移基因 菌株親緣性分析

鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，ABA）臨床分離株的耐藥性不斷上升，從多重耐藥到泛耐藥，直至極度耐藥ABA均已有報(bào)道[1-2]。近年來有學(xué)者已從ABA中檢出新型β-內(nèi)酰胺酶，如超廣譜AmpC酶ADC-56型[3]，新型金屬β-內(nèi)酰胺酶NDM-2型[4]，新型碳青霉烯酶OXA-225型。本研究對(duì)一組（20株）泛耐藥的ABA（pandrug-resistant ABA，PDR-ABA）進(jìn)行了3種與耐藥相關(guān)的看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件的遺傳標(biāo)記檢測，并對(duì)結(jié)果作了樣本聚類分析，擬探討該組菌株間的親緣關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 20株P(guān)DR-ABA均分離自2009-01— 2010-03本院ICU患者的痰液標(biāo)本。由于PDR-ABA的定義報(bào)道者各不相同，本研究PDR-ABA的判別標(biāo)準(zhǔn)參照肖永紅[5]的報(bào)道，即β-內(nèi)酰胺類藥物（包括碳青霉烯類藥物）、氨基糖苷類藥物和喹諾酮類藥物（包括左氧氟沙星）3者均耐藥才納入本研究。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃公司ATB微生物鑒定儀及配套鑒定條鑒定為ABA，并行g(shù)yrA和parC基因擴(kuò)增與測序，經(jīng)GenBank比對(duì)進(jìn)一步確認(rèn)為ABA。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，M-H瓊脂與藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2009年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗菌藥物敏感性判斷。20株菌對(duì)哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲惡唑均耐藥，僅對(duì)多粘菌素敏感。

1.3 細(xì)菌DNA提取 挑取培養(yǎng)菌落置入0.5ml離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200ng/ml蛋白酶K溶液400μl），56℃水浴2h后改95℃水浴10min，即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測 3種與耐藥相關(guān)的看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記檢測均采用PCR法。靶基因引物識(shí)別序列、目的序列引物由和基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。PCR擴(kuò)增體系均為：每反應(yīng)體系P1引物1μl（1.0μmol/L）、P2引物 1μl（1.0μmol/L）、dNTPs 2μl（2 mmol/L）、10×緩沖液2μl（含KCl 10mmol/L、（NH4）2SO48mmol/L、MgCl22mmol/L、pH 9.0 Tris-HCl 10mmol/L、NP 40 0.5%、BSA 0.02%），Taq DNA pol 1U（不計(jì)體積），超純水9μl，模板液5μl，總反應(yīng)體積20μl。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物＞500bp時(shí)PCR參數(shù)均為：93℃預(yù)變性2min，93℃60s，55℃60s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長5min。其余則為：93℃預(yù)變性2min，93℃30s，55℃30s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延長5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對(duì)照相應(yīng)的目的條帶為陽性。

1.5 基因測序 基因測序委托上海博尚生物技術(shù)有限公司，于美國ABI公司3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測序儀上完成。讀序使用Chromas軟件，測序結(jié)果直接作BLAST Search序列比對(duì)。

1.6 聚類分析 對(duì)3種與耐藥相關(guān)的看家基因和54種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記檢測結(jié)果作樣本聚類分析（Neighbour-Joining法）。

2 結(jié)果

20株P(guān)DR-ABA中3種與耐藥相關(guān)的看家基因和54種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記檢測結(jié)果見表1。其中看家基因carO、gyrA、parC均存在有義突變，parC基因除第80位密碼子為有義突變外，另有3個(gè)同義突變。parC（第80位）突變經(jīng)與美國GenBank基因庫比對(duì)為新的亞型，該基因序列已登錄于美國Gen-Bank基因庫（登錄號(hào)：JQ003194）。parC（第80位）突變部位測序圖見圖1。

20株P(guān)DR-ABA檢測結(jié)果樣本聚類分析提示，其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號(hào)菌株，7-10號(hào)菌株，8-11號(hào)菌株，12-14號(hào)菌株，17-19號(hào)菌株分別為同一克隆。其中7-10號(hào)菌株均攜帶了TEM+、PER+、ADC+、OXA-23+、aac（3）-Ⅰ+、aac（6′）-Ⅰb+、ant（3″）-Ⅰ+、adeB+、qacE△1+、tnpU+、tnp513+、IS26+、ISaba1+和intⅠ1+等14種水平轉(zhuǎn)移基因；12-14號(hào)均攜帶了TEM+、PER+、ADC+、OXA-23+、aac（6′）-Ⅰb+、ant（3″）-Ⅰ+、adeB+、qacE△1+、tnpU+、tnp513+、IS26+、ISaba1+和intⅠ1+等13種水平轉(zhuǎn)移基因。

表1 20株P(guān)DR-ABA基因檢測結(jié)果

3 討論

ABA已成為ICU患者中分離的首位細(xì)菌，多數(shù)菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類（包括碳青霉烯類）、氨基糖苷類、喹諾酮類（包括左氧氟沙星）等抗生素耐藥[6]。醫(yī)院內(nèi)感染是耐藥ABA迅速播散的主要原因，對(duì)分離的菌株進(jìn)行親緣性分析是判別醫(yī)院內(nèi)感染的有效方法。菌株親緣性分析的本質(zhì)為菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，即對(duì)所觀察的菌株的形成和發(fā)展過程進(jìn)行分析，亦即分析該均住院的進(jìn)化歷史。系統(tǒng)發(fā)育分析需要收集多種特征包括指標(biāo)和變量，而與耐藥相關(guān)的看家基因、水平轉(zhuǎn)移基因符合這一要求，且檢出的基因型與藥物敏感性表型可作直觀分析。姜如金等[7]基于看家基因與水平轉(zhuǎn)移基因的菌株親緣性分析提示，如果不考慮水平轉(zhuǎn)移基因，菌株分析中將有15種多態(tài)性被遺漏。

對(duì)所研究的一組細(xì)菌中的每一株進(jìn)行全基因組測序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行樣本聚類分析目前是菌株親緣性分析最為可靠的方法。近年來國際著名學(xué)術(shù)刊物上相繼刊登了全基因組測序后并對(duì)所發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）作聚類分析，從而解析菌株親緣性的文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]。不久前德國暴發(fā)致患者腹瀉、腸出血、腎功能衰竭的大腸埃希菌O104:H4感染，其分離的菌株也用此法進(jìn)行親緣性分析[11]。但對(duì)所研究的每一株細(xì)菌進(jìn)行全基因組測序由于價(jià)格昂貴，不適用于臨床實(shí)踐。因此，在所研究的菌株基因組中選擇一些有代表性的看家基因和水平轉(zhuǎn)移基因進(jìn)行抽樣檢測，再作樣本聚類分析成為合理的選擇[7]。

本研究中以3種與耐藥相關(guān)的看家基因和54種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合子等可移動(dòng)遺傳元件遺傳標(biāo)記測得結(jié)果作樣本聚類分析，結(jié)果顯示20株P(guān)DR-ABA中1-3-4-5-9-15-16-18-20號(hào)、7-10號(hào)、8-11號(hào)、12-14號(hào)及17-19號(hào)菌株均為克隆傳播，而且其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號(hào)菌株呈流行趨勢。其中7-10號(hào)菌株均攜帶了14種水平轉(zhuǎn)移基因，12-14號(hào)均攜帶了13種水平轉(zhuǎn)移基因，如不考慮水平轉(zhuǎn)移基因該4個(gè)菌株則無法鑒別。本研究中20株P(guān)DR-ABA經(jīng)看家基因和水平轉(zhuǎn)移基因檢測分析提示，3種看家基因均存在有義突變，并檢出多種β-內(nèi)酰胺酶基因、多種氨基糖苷類修飾酶基因和抗菌藥物外排泵基因adeB、qacE△1，同時(shí)檢出5種可移動(dòng)遺傳元件。可見本組PDR-ABA泛耐藥的表型除了看家基因carO、gyrA、parC的有義突變，還借助可移動(dòng)遺傳元件獲得了多種抗菌藥物滅活酶基因和外排泵基因。

綜上所述，與全基因組測序后并對(duì)SNPs作聚類分析解析菌株親緣性相比，看家基因和水平轉(zhuǎn)移基因樣本聚類分析實(shí)用性強(qiáng)，能夠用于對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染的實(shí)時(shí)監(jiān)測。

圖1 parC（第80位）突變部位測序圖（敏感株第80位密碼子為TCA）

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Phylogenetic analysis of drug resistance-related genes in pandrug-resistant Acinetobacter baumannii(PDR-ABA)

Objective To conduct phylogenetic analysis in 20 strains of pandrug-resistant Acinetobacter baumannii (PDR-ABA)．Methods The analysis was completed in three drug resistance-related housekeeping genes(carO,gyrA,parC) and 54 species level shift obtained with β-lactams,aminoglycosides,quinolones resistance-related genes as well as 12 kinds of bonding nature of the particles,transposons,insertion sequences,integrons and other mobile genetic elements of genetic markers in 20 pan-resistant Acinetobacter baumannii．Results In 20 strains of PDR-ABA,4 kinds of β-lactam-acquired drug resistance genes,5 kinds of aminoglycoside acquired drug resistance genes,2 kinds of acquired drug efflux genes,5 kinds of removable genetic markers genetic components were detected．There were sense mutations in housekeeping genes carO,gyrA, parC． Conclusion The cluster analysis showed that five clones spread exist in sample group of strains,and the strains 1-3-4-5-9-15-16-18-20 have epidemic trend．

Acinetobacter baumanniiHousekeeping gene Gene acquired by horizontal transfer Phylogenetic analysis

2013-12-30）

（本文編輯：胥昀）

312000 紹興市第六人民醫(yī)院感染控制科