楊越明 金法祥 鐘建平

泛耐藥鮑氏不動桿菌與耐藥相關基因檢測及親緣性分析

楊越明 金法祥 鐘建平

目的了解泛耐藥鮑氏不動桿菌（PDR-ABA）的菌株親緣性。方法 對20株PDR-ABA進行3種耐藥相關看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉移獲得的與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件的遺傳標記檢測。結果 20株PDR-ABA中檢出4種β-內(nèi)酰胺類獲得性耐藥基因，5種氨基糖苷類獲得性耐藥基因，2種獲得性抗菌制劑外排泵基因和5種可移動遺傳元件。耐藥相關看家基因carO、gyrA、parC均存在有義突變。 結論 PDR-ABA存在5個克隆傳播，其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號菌株呈流行趨勢。

鮑氏不動桿菌 看家基因 水平轉移基因 菌株親緣性分析

鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii，ABA）臨床分離株的耐藥性不斷上升，從多重耐藥到泛耐藥，直至極度耐藥ABA均已有報道[1-2]。近年來有學者已從ABA中檢出新型β-內(nèi)酰胺酶，如超廣譜AmpC酶ADC-56型[3]，新型金屬β-內(nèi)酰胺酶NDM-2型[4]，新型碳青霉烯酶OXA-225型。本研究對一組（20株）泛耐藥的ABA（pandrug-resistant ABA，PDR-ABA）進行了3種與耐藥相關的看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件的遺傳標記檢測，并對結果作了樣本聚類分析，擬探討該組菌株間的親緣關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 20株PDR-ABA均分離自2009-01— 2010-03本院ICU患者的痰液標本。由于PDR-ABA的定義報道者各不相同，本研究PDR-ABA的判別標準參照肖永紅[5]的報道，即β-內(nèi)酰胺類藥物（包括碳青霉烯類藥物）、氨基糖苷類藥物和喹諾酮類藥物（包括左氧氟沙星）3者均耐藥才納入本研究。

1.2 細菌鑒定及藥敏試驗 所有菌株均經(jīng)法國生物梅里埃公司ATB微生物鑒定儀及配套鑒定條鑒定為ABA，并行gyrA和parC基因擴增與測序，經(jīng)GenBank比對進一步確認為ABA。藥敏試驗采用紙片擴散法，M-H瓊脂與藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2009年版標準進行抗菌藥物敏感性判斷。20株菌對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、復方磺胺甲惡唑均耐藥，僅對多粘菌素敏感。

1.3 細菌DNA提取 挑取培養(yǎng)菌落置入0.5ml離心管內(nèi)（內(nèi)預置200ng/ml蛋白酶K溶液400μl），56℃水浴2h后改95℃水浴10min，即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測 3種與耐藥相關的看家基因（carO、gyrA、parC）和54種水平轉移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件遺傳標記檢測均采用PCR法。靶基因引物識別序列、目的序列引物由和基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。PCR擴增體系均為：每反應體系P1引物1μl（1.0μmol/L）、P2引物 1μl（1.0μmol/L）、dNTPs 2μl（2 mmol/L）、10×緩沖液2μl（含KCl 10mmol/L、（NH4）2SO48mmol/L、MgCl22mmol/L、pH 9.0 Tris-HCl 10mmol/L、NP 40 0.5%、BSA 0.02%），Taq DNA pol 1U（不計體積），超純水9μl，模板液5μl，總反應體積20μl。PCR擴增產(chǎn)物＞500bp時PCR參數(shù)均為：93℃預變性2min，93℃60s，55℃60s，72℃60s，共35個循環(huán)，最后72℃延長5min。其余則為：93℃預變性2min，93℃30s，55℃30s，72℃60s，共35個循環(huán)，最后72℃延長5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對照相應的目的條帶為陽性。

1.5 基因測序 基因測序委托上海博尚生物技術有限公司，于美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀上完成。讀序使用Chromas軟件，測序結果直接作BLAST Search序列比對。

1.6 聚類分析 對3種與耐藥相關的看家基因和54種水平轉移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件遺傳標記檢測結果作樣本聚類分析（Neighbour-Joining法）。

2 結果

20株PDR-ABA中3種與耐藥相關的看家基因和54種水平轉移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件遺傳標記檢測結果見表1。其中看家基因carO、gyrA、parC均存在有義突變，parC基因除第80位密碼子為有義突變外，另有3個同義突變。parC（第80位）突變經(jīng)與美國GenBank基因庫比對為新的亞型，該基因序列已登錄于美國Gen-Bank基因庫（登錄號：JQ003194）。parC（第80位）突變部位測序圖見圖1。

20株PDR-ABA檢測結果樣本聚類分析提示，其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號菌株，7-10號菌株，8-11號菌株，12-14號菌株，17-19號菌株分別為同一克隆。其中7-10號菌株均攜帶了TEM+、PER+、ADC+、OXA-23+、aac（3）-Ⅰ+、aac（6′）-Ⅰb+、ant（3″）-Ⅰ+、adeB+、qacE△1+、tnpU+、tnp513+、IS26+、ISaba1+和intⅠ1+等14種水平轉移基因；12-14號均攜帶了TEM+、PER+、ADC+、OXA-23+、aac（6′）-Ⅰb+、ant（3″）-Ⅰ+、adeB+、qacE△1+、tnpU+、tnp513+、IS26+、ISaba1+和intⅠ1+等13種水平轉移基因。

表1 20株PDR-ABA基因檢測結果

3 討論

ABA已成為ICU患者中分離的首位細菌，多數(shù)菌株對β-內(nèi)酰胺類（包括碳青霉烯類）、氨基糖苷類、喹諾酮類（包括左氧氟沙星）等抗生素耐藥[6]。醫(yī)院內(nèi)感染是耐藥ABA迅速播散的主要原因，對分離的菌株進行親緣性分析是判別醫(yī)院內(nèi)感染的有效方法。菌株親緣性分析的本質(zhì)為菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析，即對所觀察的菌株的形成和發(fā)展過程進行分析，亦即分析該均住院的進化歷史。系統(tǒng)發(fā)育分析需要收集多種特征包括指標和變量，而與耐藥相關的看家基因、水平轉移基因符合這一要求，且檢出的基因型與藥物敏感性表型可作直觀分析。姜如金等[7]基于看家基因與水平轉移基因的菌株親緣性分析提示，如果不考慮水平轉移基因，菌株分析中將有15種多態(tài)性被遺漏。

對所研究的一組細菌中的每一株進行全基因組測序，并對結果進行樣本聚類分析目前是菌株親緣性分析最為可靠的方法。近年來國際著名學術刊物上相繼刊登了全基因組測序后并對所發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）作聚類分析，從而解析菌株親緣性的文獻報道[8-10]。不久前德國暴發(fā)致患者腹瀉、腸出血、腎功能衰竭的大腸埃希菌O104:H4感染，其分離的菌株也用此法進行親緣性分析[11]。但對所研究的每一株細菌進行全基因組測序由于價格昂貴，不適用于臨床實踐。因此，在所研究的菌株基因組中選擇一些有代表性的看家基因和水平轉移基因進行抽樣檢測，再作樣本聚類分析成為合理的選擇[7]。

本研究中以3種與耐藥相關的看家基因和54種水平轉移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類藥物耐藥相關基因以及12種接合性質(zhì)粒、轉座子、插入序列、整合子等可移動遺傳元件遺傳標記測得結果作樣本聚類分析，結果顯示20株PDR-ABA中1-3-4-5-9-15-16-18-20號、7-10號、8-11號、12-14號及17-19號菌株均為克隆傳播，而且其中1-3-4-5-9-15-16-18-20號菌株呈流行趨勢。其中7-10號菌株均攜帶了14種水平轉移基因，12-14號均攜帶了13種水平轉移基因，如不考慮水平轉移基因該4個菌株則無法鑒別。本研究中20株PDR-ABA經(jīng)看家基因和水平轉移基因檢測分析提示，3種看家基因均存在有義突變，并檢出多種β-內(nèi)酰胺酶基因、多種氨基糖苷類修飾酶基因和抗菌藥物外排泵基因adeB、qacE△1，同時檢出5種可移動遺傳元件?？梢姳窘MPDR-ABA泛耐藥的表型除了看家基因carO、gyrA、parC的有義突變，還借助可移動遺傳元件獲得了多種抗菌藥物滅活酶基因和外排泵基因。

綜上所述，與全基因組測序后并對SNPs作聚類分析解析菌株親緣性相比，看家基因和水平轉移基因樣本聚類分析實用性強，能夠用于對醫(yī)院內(nèi)感染的實時監(jiān)測。

圖1 parC（第80位）突變部位測序圖（敏感株第80位密碼子為TCA）

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Phylogenetic analysis of drug resistance-related genes in pandrug-resistant Acinetobacter baumannii(PDR-ABA)

Objective To conduct phylogenetic analysis in 20 strains of pandrug-resistant Acinetobacter baumannii (PDR-ABA)．Methods The analysis was completed in three drug resistance-related housekeeping genes(carO,gyrA,parC) and 54 species level shift obtained with β-lactams,aminoglycosides,quinolones resistance-related genes as well as 12 kinds of bonding nature of the particles,transposons,insertion sequences,integrons and other mobile genetic elements of genetic markers in 20 pan-resistant Acinetobacter baumannii．Results In 20 strains of PDR-ABA,4 kinds of β-lactam-acquired drug resistance genes,5 kinds of aminoglycoside acquired drug resistance genes,2 kinds of acquired drug efflux genes,5 kinds of removable genetic markers genetic components were detected．There were sense mutations in housekeeping genes carO,gyrA, parC． Conclusion The cluster analysis showed that five clones spread exist in sample group of strains,and the strains 1-3-4-5-9-15-16-18-20 have epidemic trend．

Acinetobacter baumanniiHousekeeping gene Gene acquired by horizontal transfer Phylogenetic analysis

2013-12-30）

（本文編輯：胥昀）

312000 紹興市第六人民醫(yī)院感染控制科