徐加杰 葛明華 譚卓 方銑華 朱欣 鄭傳銘 王可敬 陳超 賞金標

CK19在口腔鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達研究

徐加杰 葛明華 譚卓 方銑華 朱欣 鄭傳銘 王可敬 陳超 賞金標

目的檢測口腔鱗狀細胞癌（OSCC）患者淋巴結(jié)標本中細胞角蛋白19（CK19）的表達情況，尋找發(fā)現(xiàn)OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移的有效分子生物學(xué)手段。 方法 應(yīng)用熒光定量RT-PCR檢測8例OSCC患者的119枚淋巴結(jié)標本中CK19 mRNA表達水平，并與HE染色及免疫組化進行比較。 結(jié)果 HE染色及免疫組化同時檢測到CK19陽性淋巴結(jié)24枚，熒光定量RT-PCR檢測到CK19陽性者48枚，HE染色及免疫組化結(jié)果CK19陰性而定量RT-PCR陽性的微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)主要分布于頸Ⅱ區(qū)。淋巴結(jié)總體微轉(zhuǎn)移率為20．17%。熒光定量RT-PCR檢測的CK19陽性淋巴結(jié)與HE染色及免疫組化比較有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=22．04，P＜0．01）。 結(jié)論 對于OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與微轉(zhuǎn)移的檢測，熒光定量RT-PCR對CK19 mRNA的檢測較HE染色和免疫組化敏感，分子病理檢測方法的應(yīng)用可以有助于腫瘤的分期判斷、預(yù)后評估及治療方案的抉擇。

口腔腫瘤 鱗狀細胞癌 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移 PCR 基因表達

口腔頜面部惡性腫瘤占全身惡性腫瘤的3.0%～4.0%，其中以口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）為主，占口腔頜面部惡性腫瘤80.0%以上。OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移是其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)之一[1]。微轉(zhuǎn)移是指非血液系統(tǒng)惡性腫瘤在發(fā)展過程中，散播并存活于淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及骨髓、肝、肺等器官中的癌細胞灶，可以是以單個癌細胞或獨立的癌細胞灶為單位，臨床上無特征性表現(xiàn)，病理檢查可為陰性。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是OSCC預(yù)后的獨立影響因素，判斷淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移對了解病情、估計預(yù)后和輔助治療有重要作用，但常規(guī)病理學(xué)及影像學(xué)方法難以發(fā)現(xiàn)和檢測某些隱匿性的微轉(zhuǎn)移癌細胞。目前研究認為檢測頭頸部腫瘤患者外周血細胞角蛋白（cytokeratin,CK）表達有助于監(jiān)測微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究檢測了OSCC患者頸部淋巴結(jié)中CK19的表達情況并分析其臨床意義，旨在為早期發(fā)現(xiàn)OSCC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2007—2008年我院就診的8例OSCC患者的淋巴結(jié)標本共119枚，其中男6例，女2例，年齡32～69歲，中位年齡55歲?；颊邽樵l(fā)或短期復(fù)發(fā)OSCC，均未行放化療。按2010年美國AJCC唇癌和口腔癌TNM分期系統(tǒng)進行病理分期，其中Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～ⅣA期4例；高分化5例，高中分化3例；TNM分期：T1N0M0期 3例，T1N1M0、T2N0M0、T2N1M0、T2N2bM0、T4aN2bM0期各1例，術(shù)后1h內(nèi)按照不同區(qū)域分離頸部淋巴結(jié)，分別取得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ區(qū)淋巴結(jié)數(shù)枚。將淋巴結(jié)編號并縱向剖開，其中一半制成5μm連續(xù)薄切片，分別行常規(guī)HE染色和免疫組化染色；另一半提取mRNA，行熒光定量RT-PCR檢測CK19 mRNA表達。標本獲取過程嚴格遵守?zé)o瘤原則，所有患者都進行術(shù)前告知及標本入庫告知。患者隨訪截止至2012年4月，隨訪時間6～62個月，平均39.4個月。

1.2 主要儀器和試劑 鼠抗人CK19單克隆抗體、抗原阻斷劑、辣根過氧化物酶購自丹麥Dako公司，兔/鼠雙標生物素化抗體(EnVisionTMplus試劑盒）購自美國Maxim Biotech公司，Trizol試劑以及引物購自美國Invitrogen公司。CK19引物序列：上游5′-ACCAAGTTTGAGACGGAACAG-3′，下游5′-CCCTCAGCGTACTGATTTCCT-3′。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime SciptTMRT reagent Kit購自日本TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑盒BioEasy SYBR Green I PCR Kit購自杭州博日公司，Applied Biosystems Prism 7500熒光定量PCR為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 標本經(jīng)脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫液抗原修復(fù)10min。以鼠抗人CK19單克隆抗體為一抗，兔/鼠雙標生物素化抗體為二抗，行免疫組化SP法染色。陽性判斷標準是：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中CK19表達位于細胞質(zhì)，鏡下觀察細胞質(zhì)呈棕黃色，細胞核為藍色（見圖1B）。

1.3.2 熒光定量RT-PCR檢測 取100mg淋巴結(jié)組織標本，Trizol法提取總RNA，每個樣本設(shè)2個平行管，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime SciptTMRT reagent Kit進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems Prism 7500熒光定量PCR儀上進行，條件如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)后72℃再延伸10 min。對PCR產(chǎn)物均進行熔解曲線實驗，以評價PCR反應(yīng)的特異性。條件如下：95℃ 15s，60℃20s，然后在20 min內(nèi)緩慢升溫至95℃。同時設(shè)置陰性及陽性對照。將標準品貯存液（2×106拷貝/μl）梯度稀釋為 2×105、2×104、2×103、2×102、2×101拷貝/μl，分別取5μl與待測樣品同時進行PCR擴增，制作標準定量曲線。標準曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.99，斜率為-2.99。標準曲線計算公式為：Y（檢測樣本起始模板濃度的對數(shù)值）=-2.9932X（檢測樣本的Ct值）+41.28。根據(jù)各檢測樣本Ct值與標準曲線計算各樣品中CK19 cDNA的初始表達量。

1.3.3 淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移判定方法 常規(guī)HE染色和免疫組化染色陰性而RT-PCR檢測CK19陽性的淋巴結(jié)判斷為微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。RT-PCR檢測CK19陽性判斷標準為：CK19拷貝＞1×104拷貝/μl。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者頸淋巴結(jié)HE染色與免疫組化結(jié)果 8例患者頸淋巴結(jié)的HE染色與相應(yīng)的CK19免疫組化染色的陽性率無差異，均為20.17%（24/119），并呈一一對應(yīng)，見圖1。

圖1 患者頸淋巴結(jié)連續(xù)切片的HE染色和免疫組化染色（A：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，HE染色；B：與A同一轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，免疫組化SP法染色；C：非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，HE染色；D：與C同一非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，免疫組化SP法染色，×200）

2.2 熒光定量RT-PCR檢測患者淋巴結(jié)CK19 mRNA的表達 熒光定量RT-PCR檢測中樣品的2個平行管實時熒光值擬合良好，表明PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定，模板分配均勻，結(jié)果可靠。結(jié)果顯示HE和CK19免疫組化染色均陽性的24枚淋巴結(jié)中，CK19 mRNA表達也呈陽性；而HE和CK19免疫組化染色均陰性的95枚淋巴結(jié)中，24枚CK19 mRNA表達陽性，微轉(zhuǎn)移率為20.17%。熒光定量RT-PCR檢測CK19 mRNA的陽性表達與HE染色及免疫組化檢測比較有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=22.04，P＜0.01）。基于HE染色、免疫組化以及熒光定量RT-PCR檢測，將所有淋巴結(jié)分成HE染色和免疫組化陽性/PCR陽性組（A組）、微轉(zhuǎn)移陽性組（B組）、HE染色和免疫組化陰性/ PCR陰性組（C組）。T2期、T4期微轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)所占比例高于T1期（χ2=7.06，P＜0.05），見表1。

表1 不同分期患者淋巴結(jié)分組特征[例（%）]

2.3 熒光定量RT-PCR檢測淋巴結(jié)CK19 mRNA表達對患者腫瘤分期及預(yù)后的影響 根據(jù)熒光定量RTPCR檢測結(jié)果對術(shù)后腫瘤分期進行重新評估，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的情況主要發(fā)生在Ⅱ區(qū)，Ⅱ區(qū)中HE染色和免疫組化陽性淋巴結(jié)與微轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)顯著高于其他區(qū)域，Ⅱ區(qū)微轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)占所有陽性淋巴結(jié)比例最高，見圖2。8例患者共30個頸淋巴結(jié)區(qū)域中有10個區(qū)域檢出微轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)（10/30），而有9個淋巴結(jié)區(qū)域HE染色和免疫組化檢測為陽性（9/30），熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果與HE染色和免疫組化檢測具有高度相關(guān)性（r=0.929，P＜0.01）。

而從術(shù)后病情的轉(zhuǎn)歸來看，微轉(zhuǎn)移陽性組的患者與微轉(zhuǎn)移陰性組的患者預(yù)后截然不同，微轉(zhuǎn)移陽性組患者均出現(xiàn)淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，而微轉(zhuǎn)移陰性組均未出現(xiàn)淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，1例患者因局部復(fù)發(fā)死亡，見表2。

圖2 患者各淋巴結(jié)區(qū)域HE染色和免疫組化陽性淋巴結(jié)與微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)比例

表2 CK19淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的區(qū)域分布及患者預(yù)后

3 討論

自1896年在外周血中首次發(fā)現(xiàn)癌細胞，腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念在臨床治療和基礎(chǔ)研究中逐步建立起來。微轉(zhuǎn)移是指非血液系統(tǒng)惡性腫瘤在發(fā)展過程中，散播并存活于淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等組織及骨髓、肝、肺等器官中的癌細胞灶，可以是以單個癌細胞或獨立的癌細胞灶為單位，尚無特殊血供，臨床上無特征性表現(xiàn)。Hamakawa等[2]指出TNM分期中N0期患者中多發(fā)的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶，可能反映了原發(fā)腫瘤具有較活躍的轉(zhuǎn)移活性。一般認為微轉(zhuǎn)移是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期階段，可能進一步發(fā)展成為病理陽性淋巴結(jié)，但對于如何評估淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后的影響目前尚有爭議。目前淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的理論支持主要有：微量癌細胞自原發(fā)灶脫落-局部生長-進入淋巴系統(tǒng)-免疫逃避-癌細胞被正常淋巴結(jié)“捕獲”-適應(yīng)新環(huán)境-微血管形成-腫瘤生長。微轉(zhuǎn)移灶癌細胞可長期處于G0期或處于細胞增殖與凋亡的平衡狀態(tài)，當(dāng)機體遭受打擊或免疫力下降時，休眠的癌細胞擺脫抑制狀態(tài)而持續(xù)增殖，最終發(fā)展為臨床轉(zhuǎn)移，病理陽性淋巴結(jié)可能是微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的晚期階段[3]。

Stoeckli等[4]根據(jù)轉(zhuǎn)移灶的直徑對口腔及口咽部鱗癌的微轉(zhuǎn)移進行研究，提示32.0%的患者出現(xiàn)以單個或成簇的癌細胞為表現(xiàn)形式的頸淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，認為雖然這些微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)對臨床預(yù)后的判斷尚未完全定論，但這樣的評估對于患者而言仍舊是重要的。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移說明癌細胞已發(fā)生擴散，可能是不良預(yù)后的重要指標。如何對這類患者進行綜合治療提高治愈率是不可忽視的，因為這有可能導(dǎo)致對腫瘤病理分期的重新評估。王洲等[5]進行了N0期食管癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)18例患者26枚淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移,分期由Ⅰ～ⅡA期提升為ⅡB～Ⅲ期，結(jié)果顯示根治性切除后的pN0期食管癌患者的腫瘤早期復(fù)發(fā)與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。同樣，根據(jù)RT-PCR檢測CK19 mRNA的結(jié)果，本研究中病例3的腫瘤病理分期直接從Ⅰ期轉(zhuǎn)變?yōu)棰笃?，可直接?dǎo)致了其治療模式的改變（單純手術(shù)→手術(shù)+術(shù)后放療）。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)OSCC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的情況主要發(fā)生在Ⅱ區(qū)，這可能和口腔的淋巴結(jié)引流途徑有關(guān)[2]，RT-PCR淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生和該區(qū)域存在陽性淋巴結(jié)具有相關(guān)性。這個證據(jù)提示從原發(fā)灶到區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移過程可能是一個多發(fā)的、有時間順序的行為，轉(zhuǎn)移時間的早晚和發(fā)展的快慢造成了該區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的不同，淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶可通過不同途徑在不同時間發(fā)展為淋巴結(jié)臨床轉(zhuǎn)移。所以如果能夠早期發(fā)現(xiàn)患者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移病灶，有利于及時調(diào)整治療策略，幫助患者獲得更好的預(yù)后。

CK是一種7～11 mm的間質(zhì)絲，是正常上皮細胞和腫瘤組織中細胞形成的主要間質(zhì)成分。對于CK的檢測，免疫組化可以彌補常規(guī)染色依靠細胞形態(tài)特點確診的缺陷。Xu等[6]的研究顯示CK19在淋巴結(jié)陽性的病例中檢出率為100.0%,并且認為檢測頭頸部腫瘤患者外周血中CK mRNA的表達有助于監(jiān)測微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。同時，Parikh等[7]對乳腺癌的研究也發(fā)現(xiàn)CK19可作為檢測微轉(zhuǎn)移的一項獨立指標。到目前為止，應(yīng)用免疫組化的方法檢測CK或CK19已成為OSCC淋巴結(jié)病理檢測中的重要檢測方法之一。

對于OSCC而言，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往意味著預(yù)后不良，也決定著術(shù)后是否需要采取輔助性治療措施（如放療和/或化療等）。臨床上發(fā)現(xiàn)術(shù)后病理淋巴結(jié)陰性的患者約5.0%～10.0%會出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，但HE染色法在檢測微轉(zhuǎn)移灶，特別是單細胞轉(zhuǎn)移灶上存在一定的難度，即便是顯色良好的免疫組化也可能存在漏檢的情況，而且受制片及閱片醫(yī)師經(jīng)驗的限制，免疫組化檢測質(zhì)控標準難以穩(wěn)定。目前熒光定量RT-PCR檢測可以絕對定量，利用熒光定量RT-PCR檢測OSCC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移具有高靈敏度的特點，但也存在具有假陽性較高的缺陷，重復(fù)設(shè)置樣本及合適的閾值有助于減少假陽性的產(chǎn)生[8]，本研究中每個樣本均設(shè)置了兩個平行管進行檢測，將CK19表達陽性判斷標準設(shè)為拷貝數(shù)＞1×104拷貝/μl，同時在取材時盡可能保證獲取的組織為淋巴組織，剔除淋巴結(jié)包膜及周邊多余的結(jié)締組織。在頭頸部鱗癌中，常規(guī)石蠟切片檢查可能遺漏頸淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，0.5mm直徑的微轉(zhuǎn)移灶被檢出可能性只有11.0%，0.2mm直徑的微轉(zhuǎn)移灶檢出的可能性僅為4.0%[9]。連續(xù)切片可以提高病理陽性淋巴結(jié)的檢出率，Eary等[10]報道在乳腺癌標本中連續(xù)切片對微轉(zhuǎn)移灶的檢出率比常規(guī)方法可以提高33.0%。雖然目前認為免疫組化處理后的常規(guī)切片在尋找微小轉(zhuǎn)移灶時具有直觀的優(yōu)勢，但在連續(xù)薄切片情況下，本研究結(jié)果顯示HE染色和CK19免疫組化染色對病灶的檢測效能無明顯差別，而熒光定量RT-PCR檢測微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的陽性檢出率更高。

OSCC是否存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，對患者術(shù)后病情轉(zhuǎn)歸可能具有一定影響。本研究中，出現(xiàn)CK19 RT-PCR陽性的患者均出現(xiàn)術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，提示淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移可能為OSCC術(shù)后淋巴結(jié)復(fù)發(fā)的高危因素。所以，筆者認為對OSCC術(shù)后標本中淋巴結(jié)CK19 RT-PCR陽性的患者應(yīng)密切隨訪，以盡早發(fā)現(xiàn)患者癌灶的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，使患者得到及時的治療。本研究所涉及的患者數(shù)量較少，尚需多中心、大樣本研究進一步證實。早期發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移并及時給予治療，這對減少OSCC術(shù)后遠處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)、爭取良好的預(yù)后、提高療效具有重要臨床意義。

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Expression of CK19 in metastatic lymph node from oral squamous cell carcinoma and its significance

ObjectiveTo evaluate the expression of CK19 in lymph nodes from oral squamous cell carcinoma and its clinical significance．Methods Expression of CK19 protein and mRNA was detected by immunohistochemistry and quantitative RT-PCR in 119 lymph nodes from 8 oral squamous cell carcinoma patients,and its relation to the metastasis detected by HE was analyzed．Results In 119 lymph nodes from 8 oral squamous cell carcinoma patients,31 positive lymph nodes were detected by HE staining and immunohistochemical staining of CK19,and 55 by quantitative RT-PCR．Micrometasis was detected in 24 out 119 lymph nodes with a micrometastatic rate of 20．17%． Conclusion Detection of CK19 mRNA expression with fluorescent quantitative RT-PCR is more sensitive for diagnosis of metastatic and micrometastatic lymph nodes,which would contribute to the re-evaluation of tumor staging and treatment．

Oral neoplasms Squamous cell carcinoma Lymph node micrometastasis PCR Gene expression

2012-09-20）

（本文編輯：胥昀）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81202127）；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（2008-134）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2010KYA033、2012KYA031、2013KYB033）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院頭頸外科（徐加杰、葛明華、譚卓、鄭傳銘、王可敬、陳超、賞金標），病理科（方銑華），浙江省腫瘤研究所（朱欣）

葛明華，E-mail:gemingh@163.com