葉健 王利民 王嬌莉 金兒

Ku80在人肺癌中的表達水平與放療前后表達變化的實驗研究

葉健 王利民 王嬌莉 金兒

目的基于Ku80在輻射誘導的DNA修復中的作用，研究不同病理類型肺癌中Ku80的表達水平，并以人肺癌A549細胞接種裸鼠模型評估放療對Ku80表達的影響。方法 使用免疫組化及熒光定量PCR分別檢測不同病理類型肺癌Ku80蛋白和mRNA的表達水平。將A549細胞接種到裸鼠上再以不同劑量的射線照射，并分別在24、48h后處死，用免疫組化及熒光定量PCR檢測Ku80蛋白和mRNA的表達水平。結果 肺癌組織表達的Ku80蛋白、mRNA水平高于正常肺組織（均P＜0．01）。在肺癌亞組中，肺腺癌和鱗癌比小細胞肺癌表達更高的Ku80蛋白、mRNA水平（均P＜0．01）。接種在裸鼠的人肺癌A549細胞經過不同劑量射線照射后Ku80 mRNA的表達增加，并具有劑量和時間依賴性。結論 Ku80在放療引起的DNA破壞過程中起到重要的作用。肺鱗癌和腺癌的Ku80表達高于小細胞肺癌，這可能是肺鱗癌和腺癌放射敏感性遜于小細胞肺癌的原因之一。Ku80表達水平可能在預測肺癌的放射敏感性方面具有重要價值，可以成為肺癌放射增敏治療的一個新靶點。

Ku80 肺癌 人肺癌A549細胞 放療

肺癌已居全球惡性腫瘤病死率的首位，目前的5年生存率＜15%，對人類健康構成了很大的威脅[1-2]。放療是目前肺癌治療中的一個非常重要的策略。放療能夠造成腫瘤細胞DNA破壞、細胞周期阻滯和細胞凋亡。然而Komuro等[3]研究發(fā)現(xiàn)癌細胞的放療抵抗性是導致部分患者放療效果不佳的重要原因。目前已證實不同的病理類型的肺癌有不同的放射敏感性，而且對放射損傷的修復能力也存在差異[4-5]。Ku蛋白是由Ku80與Ku70兩亞基緊密結合形成的異二聚體結構，在電離輻射造成的雙鏈DNA斷裂（DSBs）的同源末端結合和非同源末端結合修復途徑中發(fā)揮重要作用。Pucci等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)Ku蛋白的表達在人侵襲性乳腺癌和膀胱癌細胞中明顯高于正常細胞。由于不同病理類型的肺癌對放療的敏感性以及放療對DNA的破壞路徑不同，本研究選擇對不同病理類型的肺癌進行對比研究，以探討不同類型肺癌Ku80表達的差異以及其表達水平與放療照射劑量和照射時間的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 24例標本均來源于2008-01—2009-10本院肺癌手術患者。其中男14例，女10例，年齡40～73歲，平均57.3歲。所有患者入院前均未進行任何抗腫瘤治療。依據(jù)2004年WHO肺腫瘤組織病理學分類標準[7]，其中腺癌10例、鱗癌8例、小細胞癌6例，同時設置對照組6例。3種類型的患者平均年齡分別為（53.20±9.65）、（65.63±5.93）和（53.00±9.01）歲；鱗癌患者的年齡與另外兩組比較均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）；3組患者在性別和腫瘤分期上均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。肺癌組織取自標本中腫塊中央的非壞死部分；對照組則為標本中距腫塊5cm以上的肺組織，均經病理證實為正常肺組織。組織離體后用剪刀分離成2小塊，放入-70℃冰箱備用，分別行免疫組化和熒光定量PCR檢測。

1.2 實驗動物和細胞系 4周齡健康SPF級雌性BALB/c裸鼠42只，體重（20±5）g，購買并飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物中心。人肺腺癌細胞系A549細胞由浙江中醫(yī)藥大學實驗中心提供。

1.3 主要試劑和設備 Ku80兔多克隆抗體購于美國BioWorld technology公司，免疫組織化學二步法試劑（pv-6002試劑盒）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，反轉錄試劑盒購自日本TAKARA公司。熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，醫(yī)用圖像分析軟件購自德國Carl Zeiss公司，放療直線加速器型號為德國西門子公司產品，型號Siemens mevatron KD2。

1.4 方法

1.4.1 免疫組化檢測Ku80蛋白的表達 各組標本經4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋、切片后，通過免疫組化即用型二步法檢測Ku80蛋白的表達。切片置60℃烘烤，脫蠟；高壓熱修復后分別滴加濃度為1∶100的一抗和二抗；DAB顯色；復染、透明后封片；用PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：以細胞核內呈現(xiàn)淡黃、棕黃或者棕褐色顆粒為Ku80蛋白陽性反應，陰性對照除細胞核染成藍色外，核內無棕黃色反應物。采用Carl Zeiss Imaging Systems高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對Ku80蛋白表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度，同時測定陽性反應面積和細胞總面積并計算陽性面積率，陽性面積率=陽性反應面積/細胞總面積×100%。每例以5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。

1.4.2 熒光定量PCR檢測Ku80 mRNA的表達 Ku80引物序列上游：5′-TGGTGCGGTCGGGGAATA-3′，下游：5′-CAGAAAGGGGATTGTCAGTGC-3′，擴增片段207bp。β-actin引物序列上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴增片段186bp。擴增程序：94℃5min，94℃15s，60℃45s，共40個循環(huán)。60℃檢測熒光值，行熔解曲線實驗。將對照組的Ku80表達設定為1.000，并按此確定各實驗組Ku80的相對表達量，通過比較各組2-△△CT值（2-△△CT表示的是各組肺癌組織Ku80基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)）[8]，進行定量分析。

1.4.3 動物實驗 A549細胞以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的A549細胞，調整細胞密度為5×107個/ml。將細胞懸液0.2ml注射于裸鼠左下肢外側皮下。于接種后3周，皮下瘤組織長至約1cm×1cm大小時對負瘤裸鼠進行照射。

42只雌性裸鼠以簡單隨機法分為7組，每組6只。第1組為對照組，不行照射；第2～7組為照射組；第2組以1Gy的強度照射后24h處死取瘤；第3組以1Gy的強度照射后48h處死取瘤；第4組以4Gy的強度照射后24h處死取瘤；第5組以4Gy的強度照射后48h處死取瘤；第6組以8Gy的強度照射后24h處死取瘤；第7組以8Gy的強度照射后48h處死取瘤。瘤組織用剪刀分成2小塊，分別以免疫組化和熒光定量PCR測定Ku80蛋白和mRNA的表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，各裸鼠組和肺癌患者組均為小樣本，組間比較采用非參數(shù)的Kruskal-Wallis檢驗和Mann-Whitney檢驗；對照組和各實驗組間比較采用非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗；計數(shù)資料組間比較采用Pearson χ2和Fisher檢驗。

2 結果

2.1 不同病理類型患者肺癌組織中的Ku80蛋白和mRNA的表達 免疫組化顯示Ku80蛋白在對照組低表達；在腺癌組織中呈陽性表達，棕黃色顆粒位于細胞核內；在鱗癌組織中也為陽性表達，棕黃色顆粒位細胞核內，呈團塊或彌散分布；在小細胞肺癌組織也呈陽性表達（圖1，見插頁）。各肺癌組Ku80的陽性面積率均明顯高于對照組，且小細胞肺癌Ku80的陽性面積率明顯低于腺癌和鱗癌（均P＜0.01）。對照組和肺癌組的平均光密度無統(tǒng)計學差異；3種不同類型肺癌組的平均光密度比較也無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。各肺癌組Ku80的2-△△CT值均明顯高于對照組，小細胞肺癌Ku80的2-△△CT值明顯低于腺癌和鱗癌（均P＜0.01），說明小細胞肺癌患者的Ku80 mRNA的表達水平明顯低于腺癌和鱗癌。Ku80蛋白和mRNA表達與肺癌患者臨床特征的關系見表1，熒光定量PCR擴增產物凝膠電泳見圖2。

表1 Ku80在不同病理類型肺癌組織中表達與患者臨床特征的關系

圖1 免疫組化檢測不同病理類型肺癌中Ku80的表達（A：正常肺組織；B：肺腺癌；C：肺鱗癌；D：小細胞肺癌；免疫組化二步法

圖2 熒光定量PCR擴增產物凝膠電泳

2.2 異種移植負瘤小鼠A549細胞中Ku80的表達

2.2.1 負瘤小鼠A549細胞中Ku80的蛋白表達 第2～7組Ku80的陽性面積率和平均光密度均顯著高于對照組（均P＜0.05）。較長照射時間組陽性面積率和平均光密度更高；接受相同時間照射的組間比較，照射劑量更強的Ku80蛋白表達更高（均P＜0.05），見表2。對照組未照射負瘤小鼠A549細胞中Ku80蛋白主要表達于細胞核，呈棕黃色團塊或彌散分布，少數(shù)細胞質也有表達；第2組1Gy射線照射后24h，A549細胞核的Ku80蛋白棕黃色顆粒較第1組顏色加深；隨著照射時間延長，負瘤小鼠A549細胞中Ku80的蛋白表達呈升高趨勢（圖3，見插頁）。

2.2.2 負瘤小鼠A549細胞中Ku80的mRNA表達 第2～7組Ku80的2-△△CT值均顯著高于對照組（均P＜0.01）。接受相同照射時間的組間比較，照射劑量更強組的Ku80 mRNA表達更高；接受相同照射劑量的組間比較，較長時間照射組mRNA表達更高（均P＜0.01），見表2。

圖3 免疫組化檢測負瘤小鼠的Ku80在照射前后的表達變化（A：未照射組；B：1Gy照射后24h；C：8Gy照射后24h；D：8Gy照

表2 不同劑量和時間照射后各組負瘤小鼠A549細胞Ku80蛋白及mRNA表達

3 討論

Ku蛋白在電離輻射造成的DNA斷裂修復途徑中發(fā)揮重要作用。本研究評估了肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌和正常肺組織中Ku80的表達情況，發(fā)現(xiàn)肺腺癌、肺鱗癌、小細胞肺癌的Ku80蛋白表達主要位于細胞核，而且相對于肺腺癌和鱗癌細胞，正常肺組織和小細胞肺癌的Ku80蛋白和mRNA表達水平明顯減低，與既往報道的肺腺癌和肺鱗癌的放療效果低于小細胞癌是一致的[4-5]。

通過將人肺腺癌A549細胞接種裸鼠構建負瘤裸鼠模型，再以不同強度的射線照射后24、48h處死，筆者發(fā)現(xiàn)Ku80表達水平的增加呈劑量和照射后時間依賴性。考慮到Ku80蛋白在照射引起的DNA損傷修復中的作用，這些結果可以用來解釋肺腺癌和肺鱗癌放射敏感性不如小細胞肺癌的原因。本研究結果與Shintani等[9]報道的體外實驗顯示照射口腔鱗癌細胞導致Ku80蛋白表達上調，從而引起細胞放療抵抗一致。

DSBs是最有殺傷力的DNA破壞方式，Harper等[10]研究發(fā)現(xiàn)要維持基因組的完整首先需要修復斷裂的DNA。DSBs是細胞暴露在損傷因素下如電離輻射等的主要結果，未修復的DSBs引起細胞周期阻滯促使細胞進入死亡程序。Willmore等[11]已證實Ku80蛋白作為DNA修復蛋白，在DSBs的同源和非同源末端結合修復途徑中發(fā)揮重要作用。系列研究證實Ku缺失在不同細胞系的放射增效作用，用siRNA的方法敲除人宮頸癌Hela細胞、直腸癌HCT116細胞和乳腺上皮MCF10A細胞中的Ku后均表現(xiàn)出放射敏感性增加[12-13]。Zhang等[14]通過抑制劑下調人肺癌A549細胞的Ku80也起到了放療增效的作用，原因可能與抑制DNA修復復合體（DNA-PK）的形成，從而阻止了DNA修復有關。

最近的研究聚焦在Ku基因的表達和功能以及它在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。Muller等[15]研究發(fā)現(xiàn)增加Ku80蛋白的表達可以顯著增加慢性淋巴細胞白血病和骨髓瘤小鼠造血細胞的放療抵抗。胃癌細胞內的Ku70/Ku80蛋白表達增高存在COX-2依賴性，通過COX-2抑制劑可以減低Ku80表達從而抑制細胞增殖[16]。在人直腸癌細胞中抑制Ku80表達可以抑制細胞增殖并導致其凋亡[17]，下調Ku80表達還可增強肺癌細胞的放射敏感性，增強射線對DNA的破壞[18]。引入反義Ku70進入人肺鱗癌細胞系可以增強細胞的放、化療敏感性[19]。以上研究說明Ku蛋白是一個潛在的治療新靶點，調節(jié)Ku的水平可能是克服腫瘤放療抵抗的有效策略，并能起到放療增效的作用。

綜上所述，本研究結果顯示Ku80的表達水平在臨床上可能用于預測不同類型肺部腫瘤的放射敏感性。體內試驗則顯示人肺癌A549細胞經過不同劑量射線照射后的Ku80表達增加呈劑量和照射后時間依賴性，提示了Ku80在放療引起的DNA破壞的修復過程中可能起到重要的作用。但由于本研究樣本較小，因此有一定的局限性。以后的研究中，將在分子水平進一步研究Ku80基因的表達和作用，并將在大樣本的肺癌人群中探索抑制Ku80表達與放療增效間的關系。此外，探索年齡對Ku80表達的影響也將是一個很有意義的研究。

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Ku80 expression in lung cancer patients and nude mice bearing human lung carcinoma before and after irradiation

ObjectiveTo investigate Ku80 expression in lung cancer patients and nude mice bearing human lung carcinoma before and after irradiation． Methods Cancer tissue and pericancerous tissue specimens were collected from 24 lung cancer patients,including 10 cases of lung adenocarcinoma，8 cases of lung squamous carcinoma and 6 cases of small-cell lung carcinoma．Human lung cancer A549 cells were inoculated in BALB/c nude mice and the tumor-bearing mice were exposed to varying doses of irradiation．Immunohistochemistry and real-time PCR were applied to determine Ku80 protein and mRNA expression,respectively． Results Lung carcinoma tissue exhibited higher Ku80 mRNA and protein levels when compared with normal tissue(P＜0．01)．Lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma showed higher levels of Ku80 protein and mRNA,compared with small-cell lung carcinoma (P＜0．01)．There was a dose-dependent and time-dependent increase in Ku80 mRNA levels in tumor-bearing nude mice exposed to varying doses of irradiation．Conclusion Ku80 may be involved in DNA damage repairing,and higher Ku80 levels in non-small cell lung cancer may be associated with its lower radiosensitivity．The results indicated that Ku80 expression levels could be useful in predicting radiosensitivity of lung cancer and Ku80 may be used as a target to improve radiosensitivity in lung cancer patients．

Ku80 Lung carcinoma A549 cellRadiotherapy

2013-12-25）

（本文編輯：胥昀）

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012A002）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院呼吸內科