范德墉 談青 鄒偉華

LC-MS法檢測(cè)血液透析對(duì)尿毒癥伴心力衰竭患者地高辛血藥濃度的影響

范德墉 談青 鄒偉華

目的 研究尿毒癥伴心力衰竭患者血液透析治療中體內(nèi)地高辛血藥濃度的變化情況，為臨床合理用藥提供參考。方法 以液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法測(cè)定10例尿毒癥伴心力衰竭患者體內(nèi)地高辛血藥濃度的變化情況。 結(jié)果 地高辛血藥濃度在0．2～8．0ng/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，平均回收率98．36%～104．35%，日內(nèi)和日間精密度＜5．00%；給藥8h后的地高辛濃度均在有效范圍內(nèi)；血液透析后的4～8h，地高辛濃度出現(xiàn)“反跳”現(xiàn)象，用平均升高30．00%左右。 結(jié)論 對(duì)于血液透析患者的地高辛濃度監(jiān)測(cè)是必要的，需要實(shí)行個(gè)體化給藥。LC-MS法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

尿毒癥 心力衰竭 地高辛 血液透析 LC-MS法 血藥濃度

尿毒癥患者目前主要依賴血液透析維持生命，而心力衰竭是治療過程中最常見的并發(fā)癥之一，臨床上常用地高辛來治療[1]。由于地高辛治療指數(shù)低、安全范圍窄、藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)個(gè)體差異大，其有效治療劑量難以掌握；加上地高辛主要（80.00%～85.00%）以原藥形式通過腎臟排出，腎功能對(duì)地高辛血藥濃度影響很大，所以尿毒癥患者的地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)極為重要[2-3]。同時(shí)國(guó)外報(bào)道認(rèn)為，血液透析后一段時(shí)間內(nèi)，地高辛血藥濃度存在“波動(dòng)”現(xiàn)象，患者可能發(fā)生地高辛中毒[4]。因此，本研究以液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）法檢測(cè)尿毒癥患者血液透析前后的地高辛血藥濃度變化情況，探討個(gè)體化給藥方案的可行性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2008-01—2013-01在本院接受間歇性血液透析的尿毒癥患者10例，其中男8例，女2例；年齡44～72歲，平均（51.4±11.6）歲；體重47.5～72.0kg，平均（59.2±9.4）kg；血BUN23.6～66.0mmol/L，平均（45.5± 17.6）mmol/L，內(nèi)生肌酐清除率2.2～8.7ml/min，平均（5.4± 2.1）ml/min。透析時(shí)間4～4.5h/次，頻率3次/周，血流速度150～200ml/min，超濾率 250～400ml/h。受試者按0.125mg/d連續(xù)定時(shí)服藥7d以上，在血液透析間歇期口服地高辛0.125mg/d，服藥后0、2、4、8、12、24h抽取靜脈血1.5～2ml，分離血清待測(cè)。血液透析當(dāng)天定時(shí)服地高辛，相同時(shí)間點(diǎn)取血樣，血液透析在給藥后進(jìn)行。

1.2 儀器及藥品 GambroAK-95透析機(jī)，MS1480（血仿膜）透析器，碳酸鹽透析液。Agilent 1100 LC/MSD SL型高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括Agilent 1100二元輸液泵，電噴霧離子化接口的四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器及自動(dòng)進(jìn)樣器等）。地高辛、甲地高辛對(duì)照品（純度＞99.50%，中國(guó)藥品生物制品鑒定所），乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 地高辛血藥濃度的測(cè)定

1.3.1 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：采用Agilent Zoobax SB-C18(250mm×4.0mm，5μm)色譜柱，Diamonsil-C18保護(hù)柱；流動(dòng)相乙腈∶0.05%甲酸溶液=60∶40，流速0.8ml/ min，柱溫20℃，進(jìn)樣量10 μl。

質(zhì)譜條件：AP-ESI正離子模式，干燥氣流速12L/ min，干燥氣溫度350℃，霧化氣壓力207kPa，毛細(xì)管電壓4kV，碎片電壓100V，選擇性離子檢測(cè)（SIM）：地高辛m/z779.4[M+H]+，內(nèi)標(biāo)m/z793.4[M+H]+。

1.3.2 儲(chǔ)備液制備 精密稱取地高辛標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)對(duì)照品適量，用乙腈定容配制成100μg/ml儲(chǔ)備液，-20℃保存。

1.3.3 血清樣品處理 在1ml血清樣品中加入內(nèi)標(biāo)液10μl，充分混合均勻，加入1mol/L硫酸溶液100μl及萃取液2ml（正丙醇∶氯仿=1∶5），旋渦振蕩混合5min，5 000g離心10min，取萃取液，再加提取液2ml，重復(fù)萃取2次，合并萃取液37℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl流動(dòng)相溶解，取20μl進(jìn)行高壓液相色譜分析。

1.3.4 分析方法確證

1.3.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取空白血清1ml，不加內(nèi)標(biāo)液，其他操作與1.3.3相同，獲得空白樣品的色譜圖。將一定濃度地高辛對(duì)照品系列溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血清，按相同方法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖；同樣得到給藥后血清樣品色譜圖。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血清1ml加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，分別加入地高辛貯備液制備相當(dāng)于血清濃度為0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、4.0和8.0 ng/ml的血清樣品，其他操作與1.3.3相同，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 取空白血清1ml，分別加入地高辛貯備液制成濃度0.4、2.0和4.0 ng/ml的地高辛血清樣品，其他操作與1.3.3相同，每個(gè)濃度5個(gè)樣品，重復(fù)測(cè)定3次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。

1.3.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線下濃度為0.4、2.0和4.0 ng/ml的血清樣品，依法測(cè)定并計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。日內(nèi)差異：每個(gè)濃度樣品于1d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次；日間差異：每個(gè)濃度樣品每日測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5d。

1.3.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法配制低、中、高3個(gè)濃度的地高辛血清質(zhì)量控制樣品。經(jīng)3次 -20℃凍融及血清樣品處理后，室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定，表明本方法在24h之內(nèi)仍可對(duì)樣品濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

1.3.4.6 患者血清樣品測(cè)定 按1.3.3方法操作，每個(gè)批次制備一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)制備低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)量控制樣品，對(duì)每個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品進(jìn)行雙樣本分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一批次質(zhì)量控制樣品和未知樣品的濃度。

2 結(jié)果

2.1 地高辛血藥濃度測(cè)定方法學(xué)考察 本色譜條件下，血清樣品中內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)未干擾地高辛及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，地高辛和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.2及9.3min。地高辛濃度在0.2～8.0 ng/ml時(shí)線性良好，最低檢測(cè)限為0.1ng/ml（S∶N≥3∶1）。低、中、高濃度地高辛的平均回收率分別為98.36%、104.35%、102.23%。結(jié)果表明，該分析方法的回收率較好，符合樣品測(cè)定的相關(guān)要求。地高辛的回收率和精密度結(jié)果見表1。

表1 地高辛回收率、日內(nèi)和日間精密度數(shù)據(jù)（%）

2.2 患者地高辛血藥濃度的測(cè)定 測(cè)定結(jié)果提示10例患者給藥后8h的平均血清地高辛濃度都在有效范圍之內(nèi)，并且均小于最低中毒濃度[2]。有2例患者在透析后8h內(nèi)的血藥濃度＞2.5ng/ml，但臨床上沒有出現(xiàn)地高辛中毒的癥狀。地高辛血藥濃度與時(shí)間曲線見圖1。

圖1 患者血液透析期及透析間期的地高辛血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

地高辛中毒劑量與治療劑量非常接近，一般認(rèn)為有效血藥濃度為0.8～2.2ng/ml，而潛在中毒濃度為2.4ng/ml，因此臨床上對(duì)使用地高辛的患者都應(yīng)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[2]。國(guó)內(nèi)外有大量文獻(xiàn)報(bào)道了地高辛的血藥濃度測(cè)定方法[5-7]，目前主要有放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（CIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）、熒光免疫分析法（FIA）以及液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析法等，其中RIA法價(jià)格低廉，F(xiàn)IA法相對(duì)靈敏度高、方法簡(jiǎn)便，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最多。本研究在提高地高辛萃取率的基礎(chǔ)上，采用具有較高靈敏度和專屬性的LC-MS法測(cè)定地高辛的血藥濃度，為臨床進(jìn)行地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)、調(diào)整給藥方案提供了新的技術(shù)和手段。與以上方法比較，LC-MS法具有快速、準(zhǔn)確、抽血量小、可批量檢測(cè)、樣品清理簡(jiǎn)單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，但是該類儀器價(jià)格相對(duì)昂貴，監(jiān)測(cè)費(fèi)用也相對(duì)較高。將2種或2種以上方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、有機(jī)結(jié)合、綜合利用，將是今后主要的發(fā)展趨勢(shì)。隨著地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)方法的不斷發(fā)展，檢測(cè)結(jié)果越來越準(zhǔn)確可靠，但地高辛血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果不是用藥的唯一指南，使用地高辛治療時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床癥狀及心電圖等結(jié)果綜合考慮，選擇最佳劑量實(shí)施個(gè)體給藥，以期達(dá)到滿意的治療效果。

對(duì)于尿毒癥伴心力衰竭患者，體內(nèi)地高辛的半衰期明顯延長(zhǎng)，使用地高辛0.125mg/d維持量治療，相對(duì)不易發(fā)生蓄積中毒。但在血液透析過程中，地高辛血藥濃度存在反跳升高現(xiàn)象，可能引起中毒[4]。本研究中比較血液透析期與透析間期可知，血液透析并不能迅速降低血液中的地高辛濃度。有學(xué)者認(rèn)為血液透析4～5h內(nèi)可清除給藥量的5.00%。同時(shí)，本研究表明在血液透析后的4～8h，地高辛濃度出現(xiàn)“反跳”現(xiàn)象，平均升高30.00%左右，高于國(guó)外報(bào)道血液透析后一段時(shí)間內(nèi)，地高辛濃度平均升高20.00%左右[4]。血液透析后地高辛血藥濃度反跳升高一方面是由于血液透析使體液丟失（平均丟失3.89%±0.95%），循環(huán)系統(tǒng)血容量減少所致；另一方面，血液透析停機(jī)后血清中地高辛濃度降低使原來結(jié)合于心肌、骨骼肌、內(nèi)臟等部位的地高辛釋放入血，使血藥濃度回升。在本次研究中，雖然沒有發(fā)現(xiàn)地高辛中毒的情況，但有個(gè)別患者的地高辛濃度一度到達(dá)潛在中毒劑量。因此，在使用地高辛的尿毒癥伴心力衰竭患者中，需要特別監(jiān)測(cè)在血液透析后的地高辛血藥濃度，以減少地高辛中毒情況的發(fā)生。

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Detection of serum digoxin concentration in hemodialysis patients with heart failure and uremia by liquid chromatography-mass spectrometry

Objective To detect serum digoxin concentration in hemodialysis patients with heart failure and uremia．Methods Serum digoxin concentrations were detected by liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)in 10 patients with heart failure and uremia under hemodialysis．Results The linear rang of digoxin in LC-MS was 0．2～8．0 ng/ml,the mean relative recovery arranged from 98．36%to 104．35%,the relative standard deviations of within day and between day were all less than 5．00%(n=10)．The digoxin concentrations were in effective range 8h after drug administration,it was rebound by 30．00%4～5h after hemodialysis． Conclusion LC-MS is rapid，accurate and sensitive for monitoring serum digoxin concentrations in hemodialysis patients with heart failure and uremia．

Uremia Heart failure Digoxin Hemodialysis LC-MS Serum concentration

2013-03-25）

（本文編輯：胥昀）

313000 湖州市中心醫(yī)院腎內(nèi)科（范德墉、談青），檢驗(yàn)科（鄒偉華）