湯絢麗 孫琳 朱曉玲 胡云琴 閔曼

不同染色方法檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性患者腎組織中乙肝抗原的效果比較

湯絢麗 孫琳 朱曉玲 胡云琴 閔曼

目的 探討不同染色方法檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性患者腎組織中乙肝抗原的效果。方法收集血清HBsAg陽(yáng)性的腎穿刺患者77例，分別采用免疫熒光法和改良免疫組化法檢測(cè)腎組織HBsAg及HBcAg陽(yáng)性表達(dá)情況。結(jié)果繼發(fā)于乙肝病毒感染相關(guān)的腎小球腎炎（HBV-GN）中，HBsAg免疫熒光法及改良免疫組化法敏感性為48．1%及100%；HBcAg免疫熒光法及改良免疫組化法敏感性為22．2%及70．4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．01）。非乙肝相關(guān)性腎小球腎炎（NHBV-GN）中，HBsAg免疫熒光法及改良免疫組化法特異性為98%及96%；HBcAg免疫熒光法及改良免疫組化法特異性為100%及96%，兩種方法特異性均較高，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。乙肝抗原血癥者腎組織HBsAg及HBcAg改良免疫組化法平均陽(yáng)性強(qiáng)度明顯高于免疫熒光法（P＜0．01）。血清乙肝“大三陽(yáng)”、DNA復(fù)制者HBsAg改良免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性強(qiáng)度均明顯高于“小三陽(yáng)”及DNA不復(fù)制者（P＜0．05或0．01）。結(jié)論改良免疫組化染色法提高了乙肝抗原血癥者腎組織乙肝抗原的檢出率及腎小球疾病尤其是HBV-GN診斷的準(zhǔn)確性，同時(shí)HBsAg陽(yáng)性強(qiáng)度還可預(yù)測(cè)乙肝感染嚴(yán)重程度。

乙肝抗原血癥 乙肝相關(guān)性腎小球腎炎 免疫熒光法 改良免疫組化法

乙肝抗原血癥患者腎小球疾病發(fā)生率高，按其發(fā)病 機(jī)制分為原發(fā)性腎小球腎炎即非乙肝相關(guān)性腎小球腎炎（non-hepatitis B virus associated glomerular nephritis，NHBV-GN）和繼發(fā)于乙肝病毒感染相關(guān)的腎小球腎炎（hepatitis B virus associated glomerular nephritis，HBVGN）。自Combes等[1]1971年首次報(bào)道乙肝病毒感染引起腎病以來(lái)，乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎已成為我國(guó)常見(jiàn)的繼發(fā)性腎病之一。HBV抗原檢測(cè)方法有免疫組化法、免疫熒光法、原位分子雜交或原位聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)。由于使用方法、試劑來(lái)源的不同，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果差異較大，直接影響HBV-GN診斷的準(zhǔn)確性。免疫組化法和免疫熒光法為臨床較容易開(kāi)展的檢測(cè)方法，免疫熒光法敏感性強(qiáng)，特異性差，而免疫組化法特異性強(qiáng)，敏感性差[2]。但在臨床上染色效果究竟如何尚待討論。本研究應(yīng)用改良免疫組化法檢測(cè)，并與免疫熒光法相比較，探討兩種技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2010-01—2013-06血清HB-sAg陽(yáng)性的腎穿刺患者77例，包括乙肝攜帶（僅HBsAg陽(yáng)性）2例，“小三陽(yáng)”（HBsAg、抗HBe、抗HBc均陽(yáng)性）51例，“大三陽(yáng)”（HBsAg、HBeAg均陽(yáng)性、抗HBc或抗HBe陽(yáng)性）24例。其中男51例，女26例；年齡20～74歲，平均（42±15）歲。臨床表現(xiàn)以慢性腎小球腎炎（38例）及腎病綜合征（24例）為主。常規(guī)免疫熒光、HE及特殊染色診斷病理類型。乙肝相關(guān)性腎小球疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1990年會(huì)議紀(jì)要[3]：（1）血清HBV抗原陽(yáng)性；（2）腎組織活檢證實(shí)有腎小球腎炎，并除外狼瘡性腎炎等繼發(fā)性腎小球疾??；（3）腎組織切片中找到HBV或抗原。病理類型中，HBV-GN 27例，占35.1%，其中最常見(jiàn)的為乙肝相關(guān)性膜性腎病（12例），其次為乙肝相關(guān)性IgA腎?。?1例）。NHBV-GN以IgA腎?。?5例）為主，其次為系膜增生性腎小球腎炎（14例）。

1.2 腎組織HBV抗原的檢測(cè)

1.2.1 免疫熒光法檢測(cè) 采用間接免疫熒光法，一抗為鼠抗人HBsAg抗體及兔抗人HBcAg抗體（購(gòu)自DAKO公司）、二抗為羊抗鼠IgG/FITC及羊抗兔IgG/FITC（購(gòu)自DAKO公司）。新鮮腎組織5μm厚冰凍切片，95%冷丙酮固定10min，加適當(dāng)稀釋度的一抗，37℃濕盒孵育40min。PBS洗后分別滴加相應(yīng)的熒光二抗，37℃濕盒孵育30min，熒光顯微鏡下鏡檢。陽(yáng)性積分按強(qiáng)度及部位判斷：以陽(yáng)性最強(qiáng)的腎小球?yàn)闇?zhǔn)，節(jié)段（＜50%血管袢受累，分布于系膜區(qū)或基底膜）陽(yáng)性：0.5；彌漫（＞50%血管袢受累，分布于系膜區(qū)或基底膜）黃綠色可見(jiàn)：1；彌漫黃綠色：2；彌漫黃綠色刺眼：3。

1.2.2 改良免疫組化法檢測(cè) 采用EliVision二步法：一抗與免疫熒光法相同。二抗采用EliVision Plus免疫組化廣譜試劑盒（福州邁新公司）。石蠟包埋組織3μm厚切片，脫蠟至水，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液微波修復(fù)，自然冷卻后，用3%H2O2除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。胰蛋白酶37℃修復(fù)15min。山羊血清封閉20min后加一抗，37℃濕盒孵育1.5h。增強(qiáng)劑37℃孵育30min后使用通用型二抗37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。陽(yáng)性積分按強(qiáng)度及部位判斷：以陽(yáng)性最強(qiáng)的腎小球?yàn)闇?zhǔn)，節(jié)段陽(yáng)性：0.5；彌漫棕黃色：1；彌漫棕褐色：2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。HBsAg及 HBcAg兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度符合正態(tài)分布，用表示，采用t檢驗(yàn)；DNA復(fù)制與否，大、小三陽(yáng)組間HB-sAg及HBcAg兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性強(qiáng)度為非正態(tài)分布資料，用中位數(shù)表示，采用Mann-whitney U檢驗(yàn)；兩種方法敏感性及特異性分析以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)；免疫熒光法檢測(cè)兩指標(biāo)陰陽(yáng)性在大、小三陽(yáng)組及DNA復(fù)制與否組間分布差異采用Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1 腎組織HBsAg及HBcAg定性檢測(cè)情況 腎組織HBsAg及HBcAg免疫熒光染色呈黃綠色，改良免疫組化染色呈黃褐色，主要分布于系膜區(qū)、上皮下、基底膜內(nèi)。HBV-GN中，HBsAg、HBcAg指標(biāo)用免疫熒光法檢測(cè)，均陽(yáng)性者5例，而改良免疫組化法為19例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中HBsAg免疫熒光法敏感性為48.1%，改良免疫組化法為100%；HBcAg免疫熒光法敏感性為22.2%，而改良免疫組化法為70.4%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），說(shuō)明無(wú)論是兩指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)還是單一指標(biāo)檢測(cè)，改良免疫組化法敏感性遠(yuǎn)高于免疫熒光法。NHBV-GN中HBsAg、HBcAg指標(biāo)用免疫熒光法檢測(cè)，均陰性者49例，改良免疫組化法為47例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中單一指標(biāo)HBsAg免疫熒光法及改良免疫組化法特異性為98%及96%；HBcAg免疫熒光法及改良免疫組化法特異性為100%及96%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見(jiàn)圖1和表1、2。

2.2 腎組織HBsAg及HBcAg半定量檢測(cè)情況 乙肝抗原血癥者腎組織HBsAg免疫熒光法及改良免疫組化法平均陽(yáng)性強(qiáng)度為0.15±0.28及0.74±0.89；HBcAg免疫熒光法及改良免疫組化法平均陽(yáng)性強(qiáng)度為0.04±0.14及0.22±0.36，改良免疫組化法陽(yáng)性強(qiáng)度明顯高于免疫熒光法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），詳見(jiàn)圖2。

2.3 血清乙肝不同感染程度患者腎乙肝抗原兩種檢測(cè)方法定量比較 血清乙肝“大三陽(yáng)”及DNA復(fù)制者HB-sAg改良免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性強(qiáng)度明顯高于“小三陽(yáng)”及DNA不復(fù)制者（P＜0.05或0.01）；而免疫熒光法檢測(cè)兩種抗原在大三陽(yáng)、小三陽(yáng)組及DNA復(fù)制與否組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表3、4。

圖1 HBV-GN兩種染色方法（A：HBV-IgAN HBsAg免疫熒光法，×200；B：HBV-IgAN HBcAg免疫熒光法，×200；C：HBV-IgAN HB-sAg改良免疫組化法，×200；D：HBV-IgAN HBcAg改良免疫組化法，×200；E：HBV-MN HBsAg免疫熒光法，×200；F：HBV-MN HBcAg免疫熒光法，×200；G：HBV-MN HBsAg改良免疫組化法，×200；H：HBV-MN HBcAg改良免疫組化法，×200）

表1 HBV-GN腎乙肝抗原檢測(cè)兩種實(shí)驗(yàn)方法的敏感性比較

表2 NHBV-GN腎乙肝抗原檢測(cè)兩種實(shí)驗(yàn)方法的特異性比較

圖2 乙肝抗原血癥者腎組織乙肝抗原兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性強(qiáng)度比較（與免疫熒光法比較，**P＜0.01）

3 討論

以往報(bào)道成人HBV-GN患者臨床表現(xiàn)多樣，最多見(jiàn)為腎病綜合征，也可表現(xiàn)為腎小球腎炎，肉眼或鏡下血尿、無(wú)癥狀性蛋白尿等；病理類型常見(jiàn)于膜性腎病和IgA腎病系膜增生性腎炎[4-5]。本研究結(jié)果與以往基本一致。

表3 血清乙肝不同感染程度患者腎乙肝抗原兩種檢測(cè)方法定量比較

表4 血清乙肝不同感染程度組腎乙肝抗原兩種檢測(cè)方法定量比較

免疫熒光技術(shù)以穩(wěn)定可靠，敏感性高的優(yōu)點(diǎn)在腎組織中的應(yīng)用已有半世紀(jì)的歷史，為公認(rèn)的較好觀察方法，但乙肝檢測(cè)應(yīng)用間接免疫熒光法，其穩(wěn)定性和敏感性尚無(wú)定論。本研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)檢測(cè)HBsAg及HBcAg標(biāo)記時(shí)敏感性均較差，特異性尚可，可能是由于二抗并未連接任何放大系統(tǒng)，導(dǎo)致檢測(cè)敏感性大大降低。

傳統(tǒng)免疫組化法檢測(cè)腎組織乙肝抗原時(shí)，常因?yàn)楸尘吧囟y以判別陽(yáng)性真?zhèn)?，?dǎo)致誤診率高。陳立章等[6]用傳統(tǒng)的免疫組化法檢測(cè)HBV-GN患者腎組織HbsAg及HbcAg陽(yáng)性率僅為76.2%及42.9%，而NHBV-GN患者兩指標(biāo)陽(yáng)性率也有75%，說(shuō)明傳統(tǒng)免疫組化方法敏感性低且特異性差。本研究采用改良兩步法免疫組化染色技術(shù)，采用高溫檸檬酸鹽配合胰蛋白酶消化的兩步抗原修復(fù)方法,使抗原充分暴露；并用增強(qiáng)劑增加細(xì)胞通透性，加強(qiáng)一抗與抗原的緊密結(jié)合；繼而二抗連接多聚體信號(hào)放大系統(tǒng)，使整體敏感性大大提升。多聚物中無(wú)鏈霉菌抗生物素蛋白，不會(huì)與組織中生物素結(jié)合而造成非特異性著色或背景染色，提高了檢測(cè)方法的特異性。已有學(xué)者用該方法對(duì)HBV-GN進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乙肝抗原檢測(cè)陽(yáng)性率大大提高[7-8]。我們觀察切片后發(fā)現(xiàn)改良免疫組化法染色尤其是HBsAg陽(yáng)性定位好，強(qiáng)度可，背景較干凈，診斷準(zhǔn)確性高；且不論是兩指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)還是單一指標(biāo)檢測(cè)，其敏感性遠(yuǎn)高于免疫熒光法，而特異性差別不大；從陽(yáng)性強(qiáng)度上看，改良免疫組化法也明顯高于免疫熒光法。同時(shí)，兩指標(biāo)改良免疫組化法的陽(yáng)性強(qiáng)度與乙肝感染嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性，與蔣偉等[9]報(bào)道類似，可作為預(yù)測(cè)患者乙肝感染嚴(yán)重程度的指標(biāo)。因此，該方法是檢測(cè)腎組織乙肝抗原的首選。

總之，改良免疫組化染色法提高了乙肝抗原血癥者腎組織乙肝抗原的檢出率及腎小球疾病，尤其是HBVGN診斷的準(zhǔn)確性，兩指標(biāo)陽(yáng)性強(qiáng)度還可預(yù)測(cè)乙肝感染的嚴(yán)重程度，明顯優(yōu)于免疫熒光法，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Comparison of immunofluorescent staining with immunohistochemistry in detection of HBsAg and HBcAg in renal biopsy specimens

ObjectiveTo compare two immunochemical methods in detection of HBsAg and HBcAg in renal biopsy specimens．MethodsRenal biopsy samples were taken from 77 HBsAg positive patients with nephritis．HBsAg and HBcAg in renal tissue were detected by indirect immunofluorescent staining(IIFS)and improved immunohistochemical staining(IIHS),respectively．ResultsIn patients with hepatitis B virus-related glomerular nephritis(HBV-GN)the sensitivity of HBsAg detected by IIHS and IIFS was 100．0%and 48．1%,respectively(P＜0．01);that of HBcAg was70．4%and 22．2%,respectively(P＜0．01)．In non-HBV-GN patients,the specificity of HBsAg detected by IIFS and IIHS was 98．0%and 96．0%respectively,while that of HBcAg was 100．0%and 96．0%(P＞0．05)．The intensity score of HBsAg was 0．15 by IIFS and 0．74 by IIHS,while that of HBcAg was 0．04 by IIFS and 0．22 by IIHS,respectively(both P＜0．01)．The intensity scores of HBsAg in patients with serum positive HB-sAg,HbeAg and positive HBV-DNA were significantly higher than those with positive HBsAg,HBeAb,HBcAb and negative HBV-DNA(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionThe improved immunohistochemical staining method can increase the detection rate of renal HBAg in HBV-GN patients;and the intensity score of HBsAg is predictable for the severity of HBV infection．

HBV antigenemia HBV associated glomerulonephritis Indirect immunofluorescent staining Improved immunohistochemical staining

2013-07-17）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011KYB081）；杭州市科技局重點(diǎn)專科專病項(xiàng)目（20100733Q29）

310007 杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科（浙江省腎臟疾病防治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

湯絢麗，E-mail：tangsunshine1981168@sina.com.cn