丁耘峰 平金良 王曉紅 馬志紅

Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

丁耘峰 平金良 王曉紅 馬志紅

目的 探討Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達及其意義。方法采用免疫組化Envision二步法檢測128例浸潤性乳腺癌、38例導管內癌、30例單純性導管上皮增生及30例正常乳腺組織中Girdin蛋白的表達情況，并分析其臨床病理意義。結果Girdin蛋白在正常乳腺組織、單純性導管上皮增生、導管內癌及浸潤性乳腺癌中的陽性表達率分別為10．0%、23．3%、42．1%、51．6%，呈逐級上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。浸潤性乳腺癌組織中Girdin蛋白的表達與TNM分期、淋巴結轉移及人表皮生長因子受體2（HER-2）表達明顯相關，并與患者的生存時間也明顯相關（均P＜0．05）。結論Girdin蛋白在乳腺癌的發(fā)生、演變過程中起重要作用。其表達與患者的生存期密切相關，可作為預測乳腺癌預后的參考指標。

乳腺癌 Girdin蛋白 免疫組化 預后

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集本院2004-01—2006-12有完整臨床病理資料的手術切除乳腺浸潤性導管癌標本128例、導管內癌38例及單純性導管上皮增生30例，另取30例正常乳腺組織（取自乳癌切除標本中距腫瘤3cm以外并經病理檢查證實為正常組織）作為對照。128例浸潤性導管癌參照2003年WHO乳腺癌分類及分級標準均為非特殊類型，組織學分級Ⅰ級26例，Ⅱ級56例，Ⅲ級46例；依照國際抗癌協(xié)會乳腺癌TNM分期標準，Ⅰ期32例，Ⅱ期64例，Ⅲ期32例；患者均為女性，年齡35～78歲，中位年齡46歲；每例平均解剖淋巴結15枚，76例發(fā)生淋巴結轉移，轉移率為59.4%；所有患者術前均未接受內分泌治療或化療。

1.2 試劑 兔抗人Girdin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，CerbB-2單克隆抗體、EnVision二步法試劑盒購自丹麥Dako公司，4℃冰箱保存。

1.3 實驗方法 標本用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4μm厚切片，經脫蠟、脫苯、水化，工作濃度Girdin為1∶800，CerbB-2為1∶200，免疫組化染色方法和步驟按EnVision二步法試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照，公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判定標準 Girdin蛋白的判定標準：以胞質和（或）胞核出現棕黃色顆粒為陽性，根據染色強度和染色細胞百分比進行評定和分析，其中無染色為0分，淺染色為1分，中等染色為2分，強染色為3分；無染色細胞為0分，染色細胞≤25%為1分，染色細胞占26%～50%為2分，染色細胞＞50%為3分。將每張切片的染色強度與染色細胞百分比得分相乘為其總得分，其中0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中度陽性（++），≥6分為強陽性（+++）。通過CerbB-2免疫組化結果反映人表皮生長因子受體2（HER-2）狀況，評分標準參照乳腺癌HER-2檢測指南（2009版），0～+為陰性，+++為陽性，++經熒光原位雜交檢測驗證。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，不同組織及臨床特征者之間Girdin蛋白陽性表達率的比較及關系分析采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank檢驗判斷差異性。

2 結果

2.1 不同乳腺組織Girdin蛋白表達的比較 Girdin蛋白表達位于胞質和（或）胞核，呈棕黃色顆粒，單純性導管上皮增生和正常乳腺組織中Girdin蛋白陽性表達者均為+，導管內癌中陽性表達者以+為主，浸潤性導管癌陽性表達者大多呈++～+++（圖1-4）。不同乳腺組織Girdin蛋白表達陽性率的比較見表1。

圖1 Girdin蛋白在正常乳腺組織中呈陰性表達（EnVision二步法，×100）

圖2 Girdin蛋白在乳腺導管上皮增生中呈弱陽性表達（EnVision二步法，×200）

圖3 Girdin蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈陽性表達（EnVision二步法，×100）

圖4 Girdin蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈強陽性表達（EnVision二步法，×200）

表1 不同乳腺組織Girdin蛋白表達陽性率的比較

由表1可見，正常乳腺組織、良性導管增生、導管原位癌、浸潤性乳腺癌Girdin蛋白陽性表達率呈逐級上調，浸潤性乳腺癌與導管內癌、單純性導管上皮增生及正常乳腺組織比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=8.279、15.226、18.763，P=0.041、0.002、0.000）。

2.2 浸潤性乳腺癌不同臨床特征者Girdin蛋白陽性表達率的比較 見表2。

由表2可見，Girdin蛋白表達與乳腺癌患者TNM分期、淋巴結轉移及HER-2表達相關（均P＜0.05），而與年齡、腫塊大小及組織學分級無關（均P＞0.05）。

2.3 Girdin蛋白表達陽性與陰性者術后生存情況的比較 術后隨訪60～96個月，繪出Girdin蛋白表達陽性與陰性患者的總生存曲線，顯示Girdin蛋白的表達與患者預后有相關性（P=0.041）（圖5）。

表2 浸潤性乳腺癌不同臨床特征者Girdin蛋白陽性表達率的比較

圖5 Girdin蛋白表達陽性和陰性患者的總生存曲線

3 討論

Girdin是一個由1 870個氨基酸殘基構成的大分子蛋白質，又被命名為Akt磷酸化增強子（Akt-phosphorylation enhancer，APE），是一個新的肌動蛋白結合蛋白，通過免疫組化可檢測其表達。實驗證明Girdin是維持肌動蛋白結構所必需的物質[1-2]。肌動蛋白骨架的完整性和重組性是維持細胞形態(tài)和促使細胞運動所必須的，其骨架結構的重組被認為在腫瘤轉移過程中發(fā)揮關鍵作用[4]，因此可以認為Girdin在腫瘤細胞轉移、侵襲過程中起重要作用。

本研究結果顯示，Girdin蛋白陽性表達率從正常乳腺組織、單純性導管上皮增生到導管內癌、浸潤性乳腺癌呈逐級上調，浸潤性乳腺癌的陽性表達率與正常乳腺組織、單純性導管上皮增生及導管內癌均有統(tǒng)計學差異。這一結果與Jiang等[5]的報道相仿，提示Girdin蛋白的高表達與乳腺癌發(fā)生、演進相關。

Girdin蛋白在促進腫瘤細胞侵襲、轉移方面所起的作用可能通過以下機制：（1）參與細胞的移行及腫瘤的轉移。腫瘤轉移一直是惡性腫瘤治療所面臨的最大難題，約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤轉移[6]。體外實驗證明，Girdin蛋白參與調控細胞移行。剔除Girdin蛋白的多種細胞系，包括vero細胞、HeLa細胞、MDA-MB-231、HUVEC細胞等均現出細胞移行能力受損，腫瘤細胞體外侵襲能力下降[2]。Jiang等[5]發(fā)現，在乳腺癌動物模型中，剔除 Girdin可使腫瘤的肺轉移能力明顯下降。Garcia-Marcos等[7]發(fā)現，在人具有高轉移能力的乳腺癌、結腸癌及胰腺癌組織中，Girdin蛋白的表達明顯增強。進一步的研究發(fā)現，在Girdin蛋白高表達的結腸癌患者中，腫瘤發(fā)生轉移的時間早，患者預后差。本結果也證實Girdin蛋白表達強度與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移及HER-2表達有明顯關系，提示Girdin蛋白表達可影響乳腺癌腫瘤生物學行為。（2）Girdin蛋白具有調節(jié)細胞增殖、凋亡以及影響細胞周期的作用。Ghosh等[8]發(fā)現，Girdin蛋白可以結合并激活Gi3，后者可進一步激活PI3K-Akt信號轉導通路。鑒于PI3K-Akt信號轉導通路在細胞生長過程中有重要作用，因此Girdin蛋白必然在這個過程中發(fā)揮作用。他們還發(fā)現，在含有GEF片段缺失的 Girdin蛋白異常剪切體的細胞中，正常的Girdin蛋白表達受抑制，生長因子刺激無法激活Gαi，轉而激活有絲分裂相關的信號分子，從而影響誘導細胞有絲分裂的發(fā)生和細胞增殖[9]。Anai等[10]指出，在HepG2細胞株中剔除Girdin蛋白，則DNA的合成能力明顯下降，并能使細胞活性及增殖能力明顯下降，細胞凋亡明顯增加，同時四倍體及多倍體細胞增多。（3）Girdin蛋白對腫瘤新生血管也有促進作用。腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有非常重要的地位，此外在腫瘤的轉移中，也扮演著重要角色[11]。Kitamura等[12]報道，體外實驗顯示Girdin蛋白參與VEGF介導的血管生成作用，剔除Girdin蛋白可導致血管生成受抑制。

本研究通過測定乳腺癌組織中Girdin蛋白的表達以及分析其與臨床病理參數的關系后發(fā)現，Girdin蛋白在乳腺癌中的表達上調與腫瘤遠處轉移密切相關，其過度表達顯示更短的無瘤生存期，進一步證實Girdin蛋白有促進腫瘤侵襲與轉移的作用。本文乳腺癌患者的隨訪結果經Kaplan-Meier生存曲線分析，Girdin蛋白陽性患者生存期低于Girdin蛋白陰性，差異有統(tǒng)計學意義，故筆者認為通過對乳腺癌患者進行Girdin蛋白檢測，其結果有助于對患者做出臨床預后的評估。

綜上所述，本研究結果顯示，在正常乳腺組織、單純性導管上皮增生、導管內癌及浸潤性乳腺癌中，Girdin蛋白陽性表達率呈逐級上調；而且Girdin表蛋白達與乳腺癌進展、浸潤、轉移關系密切，并影響患者的預后。因此Girdin蛋白可作為乳腺癌一個重要的預后標志物，有望為乳腺癌的診斷和治療提供一條新的途徑，但實際應用仍有待于進一步積累資料和研究。

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Expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Girdin in breast cancer and its clinicopathological significance．MethodsEnvision immunohistochemical method was used to assess the expression of Girdin in 128 cases of invasive breast cancer,38 cases of breast cancer in situ,30 cases of ductal epithelial simple hyperplasia and 30 normal breast tissue samples．The clinicopathological significance of Girdin expression was evaluated．ResultsThe positive expression of Girdin in normal tissues,simple ductal epithelial hyperplasia,breast cancer in situ and invasive breast cancer was 10．0%,23．3%,42．1%and 51．6% respectively;there were significant differences among groups(P＜0．05)．The expression of Girdin in invasive breast cancer was positively correlated with TNM grading,lymph node metastasis and HER-2 expression;it was negatively correlated with the survival time of patients(all P＜0．05)．ConclusionThe Girdin protein may be involved in the development of breast cancer．The expression of Girdin can be used as a predictor for outcomes of invasive breast cancer．

Breast cancer Girdin Immunohistochemical Prognosis Girdin蛋白是日本學者于2005年首先發(fā)現的一種新的肌動結合蛋白，在調節(jié)細胞增殖及促進腫瘤細胞的運動等方面具有重要作用[1-3]。近年來，越來越多的研究表明，Girdin蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，尤其在乳腺癌中的地位更顯重要。本研究通過免疫組化方法檢測Girdin蛋白在乳腺癌組織中的表達情況，并結合各項臨床病理參數進行分析，旨在進一步探討其在乳腺癌臨床診治中的意義。

2013-05-27）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012KYB197）

313000 湖州市中心醫(yī)院外科

丁耘峰，E-mail:dr.dd@163.com