王春生，張志崇，張秋婷，樸善花，仇雨歌，安鐵洙

(東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

自Wilmut等［1］獲得體細胞核移植后代“多利”以來，體細胞核移植技術獲得快速發(fā)展。Baguis等［2］(1999)采用體細胞核移植技術首次獲得了克隆山羊。此外，Keefer等［3］用外源基因轉(zhuǎn)染的體細胞為核供體，通過體細胞核移植方法獲得轉(zhuǎn)基因山羊。目前，利用體細胞核移植技術已成為制作轉(zhuǎn)基因動物的有效手段。為了建立通過山羊乳汁獲得抗菌肽(Antimicrobial peptides，ABP)的方法，本研究利用在前期工作［3］獲得的中國林蛙皮膚ABP的真核表達載體Tem－GFP－pBC1，轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞以獲得便于檢測并能在山羊乳腺特異表達Tem－GFP的轉(zhuǎn)基因陽性細胞。本研究進一步開展通過體細胞核移植獲得山羊乳腺特異表達ABP的轉(zhuǎn)基因山羊的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用細胞 山羊乳腺上皮細胞(由東北農(nóng)業(yè)大學高學軍教授饋贈)。

1.1.2 主要藥品和試劑 SalI(TaKaRa);脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(invitrogen);基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa);RNA提取試劑RNAiso plus(TaKaRa)。

1.1.3 重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1 利用前期工作［3］中構建的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1，即在提取中國林蛙皮膚抗菌肽Temporin－1CEa mRNA基礎上，通過反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA。利用cDNA、pEASY－T3克隆載體和GFP基因構建獲得山羊乳腺特異表達的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1。

1.2 實驗方法

1.2.1 山羊乳腺上皮細胞的傳代 采用常規(guī)方法，將冷凍保存的山羊乳腺上皮細胞經(jīng)解凍復蘇后，在二氧化碳培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2，飽和濕度)進行培養(yǎng)。當細胞達到90%以上匯合時，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 山羊乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)基因陽性細胞的篩選 采用王春生等［5］方法，用通過SalI單酶切后線性化的重組質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1或者空載體pEASY－T3(對照組)對山羊乳腺上皮細胞進行轉(zhuǎn)染，48 h后，利用含有400 μg/mL G418(預篩選的最佳濃度)選擇培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)基因陽性細胞篩選。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定 將上述獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細胞進行傳代培養(yǎng)，觀察其細胞形態(tài)、生長曲線、冷凍復蘇后增殖特點等。此外，根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明提取上述篩選獲得的轉(zhuǎn)Tem－GFP－pBC1的陽性細胞的基因組DNA。采用根據(jù)Tem－GFP－pBC1序列設計的引物(5’－TCAAGGAGGATGGCAACA－3’和5’－GTGGACAGGTAGT GGTTATC－3’)對細胞基因組DNA進行PCR檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的Tem－GFP基因RT－PCR檢測 根據(jù)Genbank中山羊GAPDH基因序列和插入基因 Tem－GFP 序列，利用 Oligo6.0和Primer 6.0軟件，分別設計1對RT－PCR引物(GAPDH:5’－ATCACTG CCACCCAGAAGACT－3’和 5’－CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT－3’;Tem－GFP:5’－TCAAGGAGGATGGCAACA－3’和5’－GTGGACAGGTAGTGGT TATC－3’);采用Trizol法分別提取轉(zhuǎn)染前后細胞的總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;。聚合酶鏈式反應:采用25μL反應體系進行，反應混合物包括10×buffer 2.5μL(含 MgCl2)，cDNA1.5μL，引物各 0.5μL，dNTP 0.5μL，Taq 酶 0.3μL，ddH2O 19.7μL。反應條件為:94℃預變性5min，94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸10min后保存于4℃。擴增結束后，取5μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。

2 結果分析

2.1 乳腺特異性表達載體Tem-GFP-pBC1的線性化

將乳腺特異性表達質(zhì)粒Tem－GFP－pBC1經(jīng)SalI單酶切進行線性化，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，其結果，與未經(jīng)SalI單酶切的Tem－GFP－pBC1(陰性對照)的雙條帶不同，Tem－GFP－pBC1經(jīng)SalI單酶切后，僅能觀察到1條條帶(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染Tem-GFP-pBC1的山羊乳腺上皮細胞

當傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞(圖2)達到90%以上匯合時，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染經(jīng)線性化的山羊乳腺特異表達載體Tem－GFP－pBC1，其結果，在轉(zhuǎn)染后的第24 h，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到表達GFP的細胞，在轉(zhuǎn)染后的第48 h，約有60%細胞表達GFP(圖3)。

圖1 Tem－GFP－pBC1的線性化電泳圖Fig.1 SalI digestion of Tem－GFP－pBC1

圖2 傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞(50×)Fig.2 Subculture goat mammary epithelial cells(50×)

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的篩選

將上述經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h的轉(zhuǎn)Tem－GFP－pBC1陽性細胞，利用G418進行陽性細胞篩選，其結果，獲得在熒光倒置顯微鏡下發(fā)出綠色熒光(表達GFP)的轉(zhuǎn)基因陽性細胞(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的鑒定

2.4.1 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的形態(tài) 在熒光倒置顯微鏡下，轉(zhuǎn)基因陽性細胞(圖5)和傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮(圖2)一樣，分散的細胞呈現(xiàn)梭形，而堆積存在的細胞呈現(xiàn)圓形或橢圓形。當細胞達到90%以上匯合時，細胞的形態(tài)呈現(xiàn)圓形或橢圓形(圖6)。

圖3 轉(zhuǎn)染Tem－GFP－pBC1后第48 h的表達GFP的山羊乳腺上皮細胞(50×)Fig.3 goat mammary epithelial cells could express GFP after transfection 48h(50×)

圖4 篩選特異表達GFP的轉(zhuǎn)基因陽性細胞(50×)Fig.4 G418－resistant cells express GFP specially(50×)

圖5 傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因陽性細胞(50×)Fig.5 Subculture of positive transgenic cells(50×)

圖6 90%以上匯合的轉(zhuǎn)基因陽性細胞(50×)Fig.6 above 90%confluence transgenic cell(50×)

圖7 轉(zhuǎn)基因細胞的生長曲線Fig.7 The growth curve of goat mammary epithelial cells transfected by Tem－GFP－pBC1

2.4.2 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的生長曲線 將獲得的轉(zhuǎn)基因陽性細胞進行續(xù)培養(yǎng)時，于續(xù)培養(yǎng)后的第24 h開始貼壁，前4 d生長緩慢，第9天時細胞匯合至約90%，而第10天始趨于平穩(wěn)，其生長曲線呈“S”形，符合細胞生長的生物學規(guī)律(圖7)。

2.4.3 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的冷凍復蘇后的生物學特性 將冷凍保存的轉(zhuǎn)基因細胞經(jīng)復蘇后進行續(xù)培養(yǎng)，并在熒光倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)，其結果，和正常傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞一樣，分散時呈現(xiàn)梭形，當?shù)竭_90%以上匯合時，呈現(xiàn)圓形或橢圓形(圖未顯示);當對復蘇的細胞進行續(xù)培養(yǎng)時，培養(yǎng)后24 h開始貼壁，前4 d生長緩慢，第9天時細胞匯合達到90%以上，10 d后趨于平穩(wěn)，整個過程呈現(xiàn)“S”型(圖7)。

2.4.4 轉(zhuǎn)基因陽性細胞的PCR鑒定 轉(zhuǎn)染Tem－GFP－pBC1后，收集利用含G418的培養(yǎng)基篩選的具有正常增殖能力的山羊乳腺上皮細胞，提取其基因組，利用特異性引物進行PCR擴增，可得與陽性對照(Tem－GFP－pBC1質(zhì)粒)相一致的約240 bp的目的條帶(圖8)。

圖8 轉(zhuǎn)基因細胞的PCR鑒定Fig.8 PCR identification of transgenic cells

圖9 RT－PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.9 Electrophoresis of RT－PCR product

2.4.5 轉(zhuǎn)基因細胞的Tem－GFP相對表達量的檢測 將RT－PCR的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)染前后GAPDH基因表達量持平，未轉(zhuǎn)染細胞沒有檢測到抗菌肽基因的表達，而轉(zhuǎn)染細胞可以檢測到與理論值一致的目的條帶(如圖9)。

3 討論

ABP是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種由20～60個氨基酸構成的具有生物活性的小分子多肽［6－8］由于ABP具有相對分子質(zhì)量低、較好的水溶性、低抗原性和較強的熱穩(wěn)定性，且抗菌肽是通過增加原核細胞膜的通透性而誘發(fā)抑菌或殺菌，不易引起病原體對其產(chǎn)生耐藥性等生物學特性［9－10］。為了獲取ABP的方法，許多學者探索了直接利用昆蟲、兩棲類動物組織等提取ABP的方法，但是，存在操作復雜、產(chǎn)量低、成本高等缺陷，難以獲得大量高純度的ABP［11］。

自Simons等［12，13］首次利用轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺表達綿羊β－球蛋白獲得成功以來，該項技術已不斷完善。以乳腺作為生物反應器大量生產(chǎn)生物活性蛋白變得可能［14］。隨著體細胞克隆技術的不斷完善，通過外源 DNA 轉(zhuǎn)染的體細胞為核供體的體細胞核移植轉(zhuǎn)基因綿羊［15］、牛［16］、豬［17，18］和山羊［3］相繼獲得成功。上述結果表明，如果利用目的基因構建乳腺特異的表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染體細胞后獲得轉(zhuǎn)基因陽性細胞，再通過體細胞核移植的方法就有可能獲得目的基因在乳腺中特異表達的轉(zhuǎn)基因動物。

為了建立通過山羊乳汁獲得中國林蛙抗菌肽的方法，本研究在對前期工作中獲得山羊乳腺特異表達的真核表達載體Tem－GFP－pBC1轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞，并經(jīng)G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性細胞。其結果，將線性化的Tem－GFP－pBC1(圖1)轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的山羊成纖維細胞(圖2，3)后，經(jīng)G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性細胞(圖4);轉(zhuǎn)基因陽性細胞和經(jīng)冷凍復蘇的轉(zhuǎn)基因陽性細胞進行續(xù)培養(yǎng)后，其細胞形態(tài)(圖5，6)和生長曲線(圖7)均正常;經(jīng)PCR檢測Tem－GFP－pBC1已整合入山羊乳腺上皮細胞的基因組中(圖8)，且與對照組相比，轉(zhuǎn)基因細胞大量表達抗菌肽基因Tem(圖9)。上述結果表明，本研究獲得了能夠在山羊乳腺中特異表達Tem－GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因陽性細胞。能否利用該細胞通過體細胞核移植方法獲得乳腺特異表達中國林蛙抗菌肽的轉(zhuǎn)基因山羊有待于探討。

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