高 芬， 李靜虹， 張娜莎， 王俊宏， 王夢(mèng)亮

（山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006）

‘贊皇棗’黑腐病菌拮抗芽胞桿菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

高 芬， 李靜虹， 張娜莎， 王俊宏， 王夢(mèng)亮*

（山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006）

摘要以‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］為靶標(biāo)，對(duì)具有較強(qiáng)抗真菌活性的10株芽胞桿菌進(jìn)行室內(nèi)多重篩選，并采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)對(duì)篩選獲得的目標(biāo)菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和最佳發(fā)酵條件確立。結(jié)果表明：芽胞桿菌B07對(duì)靶標(biāo)菌拮抗作用良好，活體拮抗抑菌帶寬度達(dá)（8.00±0.50）mm，無(wú)菌發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為（24.44±1.37）mm，且有良好的持久性，具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值；B07發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：紅薯粉2 g／L，牛肉膏10 g／L，NaCl 10 g／L，MnSO40.02 g／L；最佳發(fā)酵條件為：種子液濃度1.5×107～2.0×108cfu／mL時(shí)，接種量5%（V／V），裝液量40 mL／250 m L，原始p H7.0，發(fā)酵溫度32℃，時(shí)間72 h。

關(guān)鍵詞贊皇棗； 黑腐病菌； 拮抗芽胞桿菌； 多重篩選； 發(fā)酵條件優(yōu)化

‘贊皇棗’（Zanhuang jujube）又名金絲大棗，是我國(guó)700多個(gè)棗品種中唯一的自然三倍體，每100 g鮮棗中維生素C含量高達(dá)383～597 mg，稱(chēng)為“活維生素丸”，居各種果品之首［1］。黑腐病是‘贊皇棗’主要果實(shí)病害之一，受害果實(shí)的病部稍有凹陷或皺折，進(jìn)而整個(gè)病果呈暗紅色；發(fā)病后期棗果實(shí)干縮成灰黑色或黑色，易脫落，味苦，不能食用［2］。近幾年來(lái)該病害發(fā)生日趨嚴(yán)重［3］，極大地影響了‘贊皇棗’的產(chǎn)量、果實(shí)品質(zhì)和商品價(jià)值。

針對(duì)該病害大多采用化學(xué)藥劑防治，雖有一定成效，但由于化學(xué)農(nóng)藥存在毒性大、殘留高、污染嚴(yán)重、對(duì)人體有危害等諸多缺點(diǎn)，且‘贊皇棗’作為鮮食品種，對(duì)防治果實(shí)病害的農(nóng)藥具有更高的使用要求，所以選用高效、低毒、低殘留的生物農(nóng)藥，對(duì)生產(chǎn)綠色或有機(jī)棗果具有重大的現(xiàn)實(shí)意義［4］。拮抗微生物不僅不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性、不污染環(huán)境、無(wú)殘留，而且其生防制劑具有高效、持久等特點(diǎn)，是植物病害生物防治中的重要可利用資源。芽胞桿菌分布廣泛，具有顯著的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力［5-6］，能忍受極端的外部環(huán)境而長(zhǎng)期存活［7］，可以制成可濕性粉劑、粉劑等各種劑型而不失活，因此，是一種理想的生防微生物。一些芽胞桿菌（Bacillus spp.）的優(yōu)勢(shì)菌株已經(jīng)開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥投入到植物病害的防治中。陳志誼［8］、黎起秦［9］等利用芽胞桿菌進(jìn)行水稻紋枯病防治，取得了良好的效果；Daivasikamani等利用枯草芽胞桿菌（Bacillussubtilis）來(lái)防治咖啡銹病，體外抑制試驗(yàn)表明：該芽胞桿菌對(duì)咖啡銹菌（Hemileia vastatrix）孢子萌發(fā)的抑制率高達(dá)68.20%，而在體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)其孢子萌發(fā)的抑制率也能達(dá)到42.98%［10］。目前，有關(guān)棗黑腐病生物防治的報(bào)道較少，僅見(jiàn)陳貽金等［11］將農(nóng)抗鏈霉素（70～140 IU／mL）、50%DT600倍液、卡那霉素（140 IU／mL）和土霉素（210 IU／mL）等在發(fā)病期內(nèi)混合使用，保果率在90%以上；李志清等［12］將3%中生菌素（800倍）、4%農(nóng)抗120（400倍）和4%雙抗（400倍）等與化學(xué)農(nóng)藥甲基硫菌靈等交替使用，防治效果也較好，但利用芽胞桿菌開(kāi)發(fā)防治棗黑腐病生防制劑的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，為尋找棗果實(shí)病害無(wú)公害防治的新途徑，本研究以從山西省石樓縣‘贊皇棗’黑腐病果中分離獲得的主要病原菌之一鏈格孢菌［Alternaria alternata（Fries）Keissler］為靶標(biāo)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的10株具較好抗真菌活性的芽胞桿菌進(jìn)行了篩選，并對(duì)篩選獲得的芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方和條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為田間試驗(yàn)的進(jìn)行和生防制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試芽胞桿菌：B01（Bacillus thuringiensis）、B02（B.cereus）、B03（B.polymyxa）、B04（B.megaterium）、B06（B.laterosporus）、B09（B.licheniformis）、B05、B07、B08、B10均為B.subtilis，上述供試菌株由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存，相關(guān)種屬鑒定數(shù)據(jù)待發(fā)表。

供試病原菌：‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌（A.alternata），由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定。

1.2 拮抗芽胞桿菌的多重篩選

1.2.1 病原菌培養(yǎng)

孢子懸液制備：將靶標(biāo)菌接PDA斜面活化120 h后，每個(gè)斜面加入無(wú)菌水5 m L，制備孢子或菌絲懸浮液（10×15倍下，30～40個(gè)／視野），置4℃冰箱備用。

菌塊制備：在制備好的PDA平板上加入孢子懸液0.2 m L，玻璃棒涂布均勻，28℃恒溫培養(yǎng)72 h，待靶標(biāo)菌長(zhǎng)滿(mǎn)全皿后，用無(wú)菌打孔器制備菌塊（直徑7 mm），待用。

1.2.2 拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液制備

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6 g／L，牛肉膏9 g／L，NaCl4g／L，MnSO40.05 g／L，p H 7.0。將待篩選的芽胞桿菌在PDA培養(yǎng)基活化48 h（28℃），然后制成終濃度為1.5×107～2×108cfu／m L的菌懸液，按4%的比例（V／V）接種至50 m L的液體培養(yǎng)基中（250 m L三角瓶），180 r／min搖床振蕩培養(yǎng)48 h（30℃）后，6 000 r／min離心10 min，取上清液，用細(xì)菌過(guò)濾器除去菌體（0.22μm），得拮抗菌無(wú)菌發(fā)酵濾液，置4℃冰箱備用。

1.2.3 活體對(duì)峙篩選

采用平板對(duì)峙法［13］篩選：挑取一環(huán)活化好的拮抗菌，在PDA平板1／2處畫(huà)線，28℃培養(yǎng)24 h后，在拮抗菌線兩邊等距離（15 mm）接入靶標(biāo)菌菌塊，28℃培養(yǎng)72 h，測(cè)量抑菌帶寬度。

1.2.4 拮抗菌搖瓶發(fā)酵篩選

用牛津杯法［14］進(jìn)行復(fù)篩菌株抑菌活性測(cè)定：將靶標(biāo)菌孢子懸液加入熔融態(tài)PDA培養(yǎng)基（30μL／70 m L PDA，20 m L／皿，9 cm平皿），制成混菌平板。凝固后，等距離放入牛津杯2個(gè)，牛津杯無(wú)菌濾液加樣量0.2 m L，28℃培養(yǎng)72 h后，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 無(wú)菌發(fā)酵濾液抑制菌絲生長(zhǎng)法篩選

采用含藥平板法［15］測(cè)定發(fā)酵液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果：把無(wú)菌發(fā)酵濾液按比例加入熔融態(tài)的PDA培養(yǎng)基中，使其最終稀釋倍數(shù)分別為10、20、40、80、160倍，制備平板（每皿20 m L）。然后將靶標(biāo)菌菌塊接入平板中央，72、120、168 h時(shí)測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑制率。相對(duì)抑制率（%）＝［（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）／對(duì)照菌落直徑］×100。

上述試驗(yàn)均設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 拮抗芽胞桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化

碳源優(yōu)化：以原始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將其中的葡萄糖（C-A）依次換為麥芽糖（C-B）、可溶性淀粉（C-C）、紅薯粉（C-D）、蔗糖（C-E）、麩皮（C-F）。按1.2.2的方法制備無(wú)菌發(fā)酵濾液，牛津杯法進(jìn)行生物測(cè)定，確定最佳碳源。

氮源優(yōu)化：在確定最適碳源基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基中的牛肉膏（N-A）依次換為蛋白胨（N-B）、豆餅粉（NC）、酵母膏（N-D）、魚(yú)粉（N-E）、氯化銨（N-F）。方法同碳源優(yōu)化，確定最佳氮源。

以上試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，選擇培養(yǎng)基中4種主要組分：碳源（X1）、氮源（X2）、NaCl（X3）、MnSO4（X4）為4個(gè)考察因素，每個(gè)因素選取5個(gè)顯著水平，采用DPS軟件設(shè)計(jì)4因素5水平正交回歸旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)組合，共進(jìn)行36組試驗(yàn)［16-18］，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。試驗(yàn)重復(fù)3次。

優(yōu)化前后培養(yǎng)基的效價(jià)對(duì)比：將優(yōu)化前后的培養(yǎng)基同時(shí)發(fā)酵，按照1.2.2的方法制備無(wú)菌發(fā)酵濾液，牛津杯法生物測(cè)定，明確培養(yǎng)基優(yōu)化后的效果。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接種量：以?xún)?yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以2%、3%、4%、5%、6%的比例（V／V）進(jìn)行接種，孢子液制備同1.2.1，無(wú)菌發(fā)酵濾液制備同1.2.2，生物測(cè)定同1.2.4，確定最佳接菌量。

初始p H：在接種量確定的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基初始p H分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，同上試驗(yàn)，確定最佳初始p H。

裝液量：在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，裝液量分別為20、30、40、50、60 m L（250 m L三角瓶）時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，同上試驗(yàn)，確定最佳裝液量。

發(fā)酵溫度：在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別于20、24、28、32、36℃下發(fā)酵，同上試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵時(shí)間：在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別發(fā)酵培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，同上試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

以上試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。所有結(jié)果采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗芽胞桿菌的多重篩選

通過(guò)平板對(duì)峙法對(duì)10株芽胞桿菌進(jìn)行初篩，其中菌株B01、B05、B07有明顯拮抗效果，抑菌帶寬度分別為（9.25±0.96）、（8.00±0.50）和（8.00± 0.50）mm，遠(yuǎn)大于其他備篩菌株。上述3株菌的無(wú)菌發(fā)酵濾液活性測(cè)定表明：菌株B01、B07抑菌圈直徑分別為（17.44±3.16）和（24.44±1.37）mm，而菌株B05抑菌圈直徑僅為（12.13±1.66）mm，因此選取菌株B01、B07進(jìn)入下步篩選。

菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：同等稀釋倍數(shù)下，B07的抑菌率明顯高于B01，在稀釋10倍時(shí)，B07的抑菌率可達(dá)54%；相同時(shí)間下，隨著稀釋倍數(shù)的增加，B01和B07發(fā)酵液對(duì)靶標(biāo)菌的抑制率也隨之下降（圖1），但B01抑菌活性的下降速度明顯比B07快。在發(fā)酵液稀釋160倍，168 h時(shí)測(cè)定抑菌活性發(fā)現(xiàn)：B07發(fā)酵液的抑菌率仍達(dá)36%，而B(niǎo)01的抑菌率僅為13%，說(shuō)明菌株B07代謝產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)有較好的持效性。

圖1 芽胞桿菌B01和B07無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 The inhibition effects of bacteria-free filtrate of B01 and B07 on mycelial growth

2.2 拮抗芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源優(yōu)化

在供試的6種碳源中，以紅薯粉、淀粉、蔗糖和麥芽糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液的抑菌效果較好，且活性依次略有降低，但四者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從實(shí)際應(yīng)用和發(fā)酵成本考慮，選用紅薯粉作為碳源。在供試的6種氮源中，以牛肉膏為氮源進(jìn)行發(fā)酵后，發(fā)酵液的抑菌效果顯著高于其他5種氮源，故選用牛肉膏作為氮源（圖2）。

2.2.2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，由方差分析（表1）可知，回歸方程的失擬性檢驗(yàn)F1＝2.202 14＜F0.05（10，11）＝2.85不顯著，可以認(rèn)為所選定的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)模换貧w方程的顯著性檢驗(yàn)F2＝2.396 98＞F0.05（14，21）＝2.20顯著，說(shuō)明方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的配合是可行的，可用來(lái)建立模型［19］，故認(rèn)為僅就各試驗(yàn)因素而言，方程回歸結(jié)果是可靠的。最終獲得的優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為：紅薯粉2 g／L，牛肉膏10 g／L，NaCl 10 g／L，MnSO40.02 g／L。

通過(guò)優(yōu)化前后的培養(yǎng)基效價(jià)對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)得原始培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（26.25±0.71）mm，而優(yōu)化后可達(dá)（30.50±1.52）mm，抑菌活性提高了16.2%，表明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基更利于B07菌株代謝產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。

圖2 不同碳、氮源對(duì)芽胞桿菌B07發(fā)酵后抗菌物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of carbon and nitrogen sources on antifungal substances from Bacillus B07

表1 回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方差分析1）Table 1 Analysis of variance test of quadratic orthogonal rotation combination design

2.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接菌量：在接種量占發(fā)酵液總體積2%～5%的范圍內(nèi)，菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨接種量的上升而上升，且在接種量占發(fā)酵液總體積的5%時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高。接種量＞6%時(shí)，發(fā)酵液抑菌活性有所降低（圖3a）?？梢?jiàn)，在一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量的多少與抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量有關(guān)，菌量太小不能充分利用發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分；菌量過(guò)多則導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分不足，使抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量受到影響。當(dāng)接種量控制在5%時(shí)可得到較好的發(fā)酵效果。

初始p H：在不同初始p H條件下，菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨著p H的升高緩慢上升，當(dāng)p H＝7時(shí)達(dá)到最高，此后開(kāi)始緩慢下降，但各處理間差異不顯著，說(shuō)明初始p H在5.0～9.0的范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)酵液的抑菌活性影響不大，但以p H 7.0時(shí)為最佳。這可能和芽胞桿菌對(duì)極端環(huán)境有極強(qiáng)的抗逆能力，弱酸弱堿條件對(duì)菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有造成太大的影響有關(guān)（圖3b）。

裝液量：菌株B07發(fā)酵液的抑菌活性隨裝液量增加緩慢上升，當(dāng)裝液量＞40 m L時(shí)抑菌活性開(kāi)始緩慢下降。裝液量為20～60 m L／250 m L的范圍內(nèi)，各處理間抑菌活性無(wú)顯著差異，但以40 m L最佳，說(shuō)明裝液量在40 m L時(shí)，營(yíng)養(yǎng)成分的供應(yīng)和通氣量達(dá)到了良好的平衡（圖3c）。由于裝液量的多少直接影響到培養(yǎng)瓶中的氧氣含量，氧氣的量供應(yīng)不足會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)素量降低［16］。因此，以該裝液量為后續(xù)試驗(yàn)選用的裝液量。

發(fā)酵時(shí)間：B07發(fā)酵液的抑菌活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵72 h時(shí)抑菌活性達(dá)到最佳，而84 h時(shí)抑菌活性無(wú)明顯變化，可見(jiàn)72 h是其發(fā)酵的最佳時(shí)間，既保證了抗菌物質(zhì)達(dá)到最大產(chǎn)生量，又節(jié)約了時(shí)間（圖3d）。

溫度：發(fā)酵溫度在24～32℃之間時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性逐步上升，在32℃時(shí)達(dá)到最高，36℃時(shí)開(kāi)始下降（圖3e），但28℃和32℃處理間無(wú)顯著差異，所以28～32℃都可視為適合發(fā)酵溫度，以32℃為佳。

圖3 不同發(fā)酵條件對(duì)芽胞桿菌B07產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different fermentation conditions on antifungal substances from Bacillus B07

綜上所述，B07搖瓶發(fā)酵的最佳條件為：種子液濃度1.5×107～2×108cfu／m L時(shí)，接種量5%（V／V），裝液量40 m L／250 m L三角瓶，起始p H7.0，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間72 h。

3 討論

生物防治是未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要措施，而分離篩選高效拮抗菌是進(jìn)行生物防治研究的基礎(chǔ)［20-21］。本研究通過(guò)對(duì)10株有抗真菌活性的芽胞桿菌進(jìn)行多重篩選，從中獲得一株對(duì)‘贊皇棗’黑腐病主要病原菌鏈格孢菌（A.alternata）具有良好抑菌活性的菌株—枯草芽胞桿菌B07。該菌株在活體對(duì)峙培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩中，表現(xiàn)出了顯著而穩(wěn)定的抑菌效果，同時(shí)也顯示出了較好的持效性。枯草芽胞桿菌的研究與應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外已有100多年的歷史，作為一種安全、高效、多功能和極具開(kāi)發(fā)潛力的微生物菌種已廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)及科研諸領(lǐng)域［22］。為此，我們對(duì)菌株B07的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組合和室內(nèi)搖瓶發(fā)酵的最佳條件，為進(jìn)入中試發(fā)酵和田間試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

本研究篩選獲得的芽胞桿菌B07雖然在室內(nèi)篩選中表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，具有作為生物農(nóng)藥的潛力，但是由于生防制劑在使用過(guò)程中，受不同地區(qū)生態(tài)條件，包括溫濕度、降雨量、土壤結(jié)構(gòu)、p H、含水量以及微生物區(qū)系等因素的影響［23］，田間的防治效果和室內(nèi)的抑菌結(jié)果不具有完全的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而還需在芽胞桿菌B07發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行中試發(fā)酵，進(jìn)一步明確其田間防治效果。另外，由于棗黑腐病由多個(gè)病原菌引起，單純施用對(duì)一種菌具有拮抗效果的生防制劑，不一定能起到最優(yōu)的防治效果，所以，B07與多種拮抗菌株聯(lián)合使用時(shí)，能否保持較好的拮抗效果也是后續(xù)生防制劑開(kāi)發(fā)需要考慮的問(wèn)題。

此外，抑菌有效組分的分離、活性物質(zhì)理化性質(zhì)的測(cè)定以及安全性試驗(yàn)等方面的工作也有待進(jìn)一步深入開(kāi)展。

參考文獻(xiàn)

［1］ 及華，關(guān)軍鋒，竇世娟，等.采后贊皇大棗不同包裝處理的生理生化性狀差異［J］.果樹(shù)學(xué)報(bào)，2004（6）：540-543.

［2］ 孫兆軍.棗黑腐病的發(fā)病癥狀及防治措施［J］.煙臺(tái)果樹(shù)，2009（1）：54-55.

［3］ 李志清，常聚普，程國(guó)華，等.棗黑腐病防治技術(shù)研究［J］.林業(yè)科技通訊，2000（12）：10-12.

［4］ 魏天軍，魏象廷.中國(guó)棗果實(shí)病害研究進(jìn)展［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006（1）：88-94.

［5］ 劉煥利，潘小玫，張學(xué)君，等.產(chǎn)抗菌蛋白芽孢桿菌的篩選及抗菌蛋白性質(zhì)［J］.中國(guó)生物防治，1995（4）：17-21.

［6］ Arima K，Kakinuma A，Tamura G.Surfactin，a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillussubtilis：isolation，characterization and its inhibition of fibrin clot formation［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，1968，31（3）：488-494.

［7］ Shoda M.Bacterial control of plant diseases［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，89（6）：515-521.

［8］ 陳志誼，許志剛，高泰東，等.水稻紋枯病拮抗細(xì)菌的評(píng)價(jià)與利用［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2000，14（2）：98-102.

［9］ 黎起秦，林緯，陳永寧，等.芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病的防治效果［J］.中國(guó)生物防治，2000（4）：160-162.

［10］Daivasikamani S，Rajanaika.Biological control of coffee leaf rust pathogen，Hemileia vastatrix Berkeley and Broome using Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescens［J］.Biopesticides，2009，2（1）：94-98.

［11］陳貽金，陳謨林，朱林元.棗縮果病及其防治技術(shù)研究［J］.林業(yè)科技通訊，1989（8）：3-7.

［12］李志清，張兆欣，田國(guó)忠，等.棗黑腐病田間藥劑防治技術(shù)研究［J］.中國(guó)森林病蟲(chóng)，2005（5）：3-6.

［13］林福呈，李德葆.枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S9對(duì)植物病原真菌的溶菌作用［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003（2）：174-177.

［14］董金甫，李瑤卿.茶多酚抑菌作用的研究［J］.生物學(xué)雜志，1992（4）：19-22.

［15］沈光斌，周明國(guó).水稻白葉枯病菌對(duì)噻枯唑的抗藥性監(jiān)測(cè)［J］.植物保護(hù)，2002（1）：9-11.

［16］任丹，辜運(yùn)富，張小平，等.二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)在紫芝液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011（2）：681-686.

［17］童成立，賀喜全，盛良學(xué).農(nóng)業(yè)試驗(yàn)中正交旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)分析模型［J］.計(jì)算機(jī)與農(nóng)業(yè)，2000（10）：16-20.

［18］王惠，吳兆亮，童應(yīng)凱，等.應(yīng)用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化黃霉素發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006（6）：19-22.

［19］張曉娜，周素梅，王世平.二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)麥麩中阿拉伯木聚糖酶解工藝的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2008（1）：141-145.

［20］張慧，楊興明，冉煒，等.土傳棉花黃萎病拮抗菌的篩選及其生物效應(yīng)［J］.土壤學(xué)報(bào)，2008（6）：1095-1101.

［21］Cook R J.Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens［J］.Annual Review of Phytopathology，1993，31：53-80.

［22］惠明，竇麗娜，田菁，等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（27）：11623-11624，11627.

［23］van Rij E T，Wesselink M，Chin-A-Woeng T F C，et al.Influence of environmental conditions on the production of phenazine-1-carboxamide by Pseudomonas chlororaphis PCL1391［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17（5）：557-566.

中圖分類(lèi)號(hào)：S 476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.012

收稿日期：2013-07-15

修訂日期：2013-10-29

基金項(xiàng)目：科技部創(chuàng)新方法專(zhuān)項(xiàng)（2010IM020700）

*通信作者E-mail：mlwang＠sxu.edu.cn

In vitro screening of antagonistic Bacillus against Alternaria alternata and optimization of fermentation factors

Gao Fen， Li Jinghong， Zhang Nasha， Wang Junhong， Wang Mengliang
（Institute of Applied Chemistry，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

AbstractMultiple in vitro screening of 10 Bacillus strains against Alternaria alternata（Fries）Keissler was conducted.The optimum fermentation medium and fermentation conditions for the selected strain were determined by using quadratic orthogonal rotation combination design and single-factor experiment design，respectively.The results showed that the strain Bacillus B07 had obvious and stable antagonistic effect on A.alternata.The inhibition belt of the living body was up to（8.00±0.50）mm in width，and the inhibition zone of the bacteria-free filtrate was（24.44±1.37）mm in diameter.With lasting inhibition effect，Bacillus B07 had great potential for a commercial development.The optimum fermentation medium for strain B07 consisted of 2 g／L sweet potato powder，10 g／L beef extract，10 g／L NaCl，and 0.02 g／L MnSO4.The optimum fermentation conditions were defined as follows：inoculation amount，5%（V／V）with a seed broth concentration of 1.5×107－2.0×108cfu／m L，40 m L media in a 250 m L flask，initial p H at 7.0，and fermentation at 32℃for 72 h.

Key wordsZanhuang jujube； black rot； antagonistic Bacillus spp.； screening； optimization