張建業(yè)， 陳 星， 孫云峰

（1.河南省南陽市食品藥品檢驗所， 河南 南陽 473061； 2.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 遼寧 沈陽110847）

RP-HPLC法同時測定新生化顆粒中羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨

張建業(yè)1， 陳 星1， 孫云峰2

（1.河南省南陽市食品藥品檢驗所， 河南 南陽 473061； 2.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院， 遼寧 沈陽110847）

目的 建立同時測定新生化顆粒 (當歸、 川芎、 桃仁等) 中羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨的 RPHPLC方法。 方法 采用反相高效液相色譜法。 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) ， 以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液為流動相， 梯度洗脫， 檢測波長 237 nm， 體積流量 1.0mL/min。 結(jié)果 羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨的線性范圍分別為 5.302 4 ～106.047 4 μg/mL(r=0.999 9)， 4.689 2 ～93.783 4 μg/mL(r=0.999 9)，3.5 ～70 μg/mL(r=0.999 9)； 平均回收率分別為 99.60%(RSD為 0.96%)， 99.32%(RSD為 1.24%)， 99.83% (RSD為 1.49%)。 結(jié)論 本方法能夠準確測定新生化顆粒中羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨的量。

羥基紅花黃色素 A； 阿魏酸； 甘草酸銨； 新生化顆粒； RP-HPLC法

新生化顆粒由當歸、川芎、桃仁、甘草(炙)、 干姜 (炭)、 益母草、 紅花等七味藥材組成，系國家醫(yī)保乙類、新農(nóng)合產(chǎn)品，是產(chǎn)后康復(fù)的常用藥品。具有活血、祛瘀、止痛之功效，用于產(chǎn)后惡露不行、少腹疼痛，也可試用于上節(jié)育環(huán)后引起的陰道流血，月經(jīng)過多。為了提高藥品質(zhì)量，保證其臨床用藥的穩(wěn)定性，特對新生化顆粒中的當歸、川芎、紅花和甘草四種藥材中主要成分羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨作為指標成分，進行 RP-HPLC測定方法的研究［1-15］。

1 儀器與試藥

Waters 2695 液相色譜儀， Waters2996 光電二級陣列管檢測器 (美國沃特世公司)， Empower 2色譜工作站； CQ-250 型超聲波清洗器 (上海船舶電子設(shè)備研究所)； BP211D電子天平 (德國賽多利斯公司)。羥基紅花黃色素 A對照品 (中國藥品生物制 品 檢 定 所， 批 號 111637-200905， 純 度 以91.8%計)， 阿魏酸對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號 111773-201012，純度 以 99.6% 計)，甘草酸銨對照品 (中國藥品生物制品檢定所， 批號 110731-200614)； 新生化顆粒 ( 遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院自制， 規(guī)格 6 g/袋， 批號為 130401、130402、 130403)， 甲醇、 乙腈為色譜純， 水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 Agilent Eclipse XDB-C18色 譜 柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)； 以甲醇為流動相 A，以乙腈為流動相 B， 以0.7%磷酸溶液為流動相 C，按表 1 進行梯度洗脫； 體積流量 1.0 m L/min； 檢測波長 237 nm； 柱溫 30 ℃； 進樣量 10 μL。 理論塔板數(shù)按羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨計算均應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 G radient elution manner

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品、阿魏酸對照品和甘草酸銨對照品各14.44、 11.77、 8.75 mg，置 50 mL量 瓶 中，加25%甲醇至刻度， 搖勻， 即得含 0.265 1 mg/mL羥基紅花黃色素 A對照品、 0.234 5 mg/m L阿魏酸對照品和 0.175 0 mg/m L對照品的貯備液； 精密吸取對照品貯備液 5 mL置 25 mL量瓶中， 加 25%甲醇至刻度， 即得含 53.023 7μg/mL羥基紅花黃色素A、 46.891 7 μg/mL阿魏酸和 35 μg/mL甘草酸銨的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取新生化顆粒6.0 g， 置具塞錐形瓶中，精密加入 25%甲醇 25 mL， 密塞，稱定質(zhì)量， 超聲處理 (功率 250 W，頻率 40 kHz)30 min， 放冷， 用 25%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按新生化顆粒處方制得各不含當歸、川芎、紅花、甘草的樣品；按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、 陰性樣品溶液 10 μL進樣，結(jié)果羥基紅花黃色素 A的保留時間為9 min 左右， 阿魏酸的保留時間為 19 min 左右， 甘草酸銨的保留時間為 35 min 左右， 陰性樣品對測定無干擾， 分離度良好(R＞1.5)。 見圖 1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液 1.0、5.0、 10.0、 15.0、 20.0 μL， 分別注入液相色譜儀， 測定。以對照品峰面積 (y) 為縱坐標， 質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標，繪制成標準曲線， 求得羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨回歸方程分別為y=7 780.5x+3 087.7(r=0.999 9)、 y= 21 001.0x+13 866.0(r=0.999 9)、y=3 857.6x+ 1 322.2(r=0.999 9)， 線性范圍分別為 5.302 4 ～106.047 4 μg/mL、 4.689 2 ～93.783 4 μg/mL、3.5 ～70 μg/m L。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液， 重復(fù)進樣6 次， 每次進樣10 μL， 測得羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨的峰面積， 其 RSD分別為 0.74%、0.28%和 0.97%， 表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品 6 份， 按“2.2.2” 項下方法制備樣品溶液， 測得羥基紅花黃色素 A、 阿魏酸和甘草酸銨的峰面積， 其 RSD分別為 1.24%、 0.87%和 1.71%， 表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份樣品液， 每次進樣10 μL， 分別在 0、 2、 4、 8、 10、 12 h 進樣，記錄羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨的峰面積， 結(jié) 果 其 RSD 分 別 為 1.43%、 1.33% 和1.75%， 表明供試品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含有量的樣品 (批號 130401)6 份， 每份約 3.0 g， 精密稱定。 置錐形瓶中，每2份分別精密加入混有一定量的對照品25 mL， 按 “2.2.2”項下制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條分別測定。 計算平均回收率，結(jié)果見表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.9 樣品測定 精密稱取 3 批樣品， 按 “2.2.2”項下制成供試品溶液， 進樣10 μL分別測定。 照外標法 (峰面積) 計算， 結(jié)果見表3。

表 2 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3 樣品測定結(jié)果 （n=6）Tab.3 Content determ ination of sam ples（n=6）

2.10 陰性樣品測定 精密稱取缺少一味藥材的陰性樣品， 按 “2.2.2”項下制成供試品溶液， 進樣10 μL分別測定。 照外標法 (峰面積) 計算， 結(jié)果見表4。

表 4 陰性樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.4 Content determ ination of blank samples（ n=3）

3 討論

3.1 關(guān)于檢測波長的選擇， 通過光電二級管陣列檢測器全波長掃描 (190 nm～420 nm) 得知， 羥基紅花黃色素 A最大吸收峰波長為 403 nm，次高峰波長為 239 nm， 阿魏酸最大吸收峰波長為 324 nm， 次高峰波長為 236 nm， 甘草酸銨最大吸收峰波長為 237 nm， 所以經(jīng)綜合考慮選擇檢測波長237 nm。

3.2 供試品溶液的制備主要參考了 《中國藥典》2010 年版一部中 “川芎”、“當歸” “紅花”“甘草”藥材含量測定下的制備方法，通過比較選擇了 25%甲醇、 50%甲醇、 70%甲醇作為提取溶劑，從測定結(jié)果的比較可以看出， 采用 70%甲醇提取時， 雜質(zhì)最少， 采用 25%甲醇提取時，羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨的提取總量最高，綜合考慮， 最終選定25%甲醇作為提取溶劑。 采用超聲處理， 分別采用超聲 20 min、 30 min、 40 min 進行試驗，發(fā)現(xiàn)主成分的量，隨著超聲時間的增長而增加， 但超聲 30 min 以后無明顯增加， 所以采用超聲 30 min 進行提取。

3.3 實驗結(jié)果表明， 本方法準確快速， 可同時測定新生化顆粒中當歸、川芎、紅花、甘草四種藥材中主成分羥基紅花黃色素A、阿魏酸和甘草酸銨的量，方便更有效地控制質(zhì)量。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北 京: 中 國 醫(yī) 藥 科 技 出 版 社， 2010:38， 80，124， 141.

［ 2 ］ 毛阿娟， 王曉雯， 王世祥， 等.HPLC法測定活血膠囊中羥基紅花黃色素 A、 柚皮苷［J］.中成藥， 2011， 33(10): 1733-1736.

［3］ 黃艷萍， 黃勇紅.當歸調(diào)經(jīng)片的薄層鑒別和阿魏酸的測定［J］.中國實驗方劑學雜志， 2010， 16(6):119-121.

［ 4 ］ 寧宇杉， 曾順澤， 彭 果， 等.LC-MS/MS 法測定藏藥十三味紅花丸中羥基紅花黃色素 A的含量［J］.中國藥房，2012， 23(27):2538-2541.

［5］ 彭 紅，付建武，余日躍.復(fù)方當歸注射液中羥基紅花黃色素 A和阿魏酸的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2009，20(12):2925-2927.

［ 6 ］ 高光偉， 馮向東.HPLC梯度洗脫法測定舒胸片中羥基紅花黃色素 A和阿魏 酸的含量［ J］.中國 藥師， 2010， 13 (7):971-973.

［7］ 鄭永彪， 魏玉海.七味紅花殊勝丸中藥材的鑒定及羥基紅花黃色素 A的測定［J］.華西藥學雜志， 2011， 26(4): 395-396.

［ 8 ］ 鄭達敏， 馬再鴻.HPLC法測定佛手散中阿魏酸的含量［J］.中國醫(yī)藥指南， 2012， 10(18):53-54， 57.

［9］ 馮建忠， 惠 慧.兩種不同方法測定注射用阿魏酸鈉的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2012， 6(15):125-126.

［10］ 劉進懷， 張 晴， 薛 彬， 等.HPLC測定降糖明目顆粒中羥基紅花黃色素 A的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2010， 16(11):48-49.

［11］ 白風英.HPLC法測定新紅花-8 味丸中羥基紅花黃色素 A的含量［J］.北方藥學， 2012， 9(4):2-3.

［12］ 韓占友.HPLC法測定蒙藥敖樂木斯-5 中羥基紅花黃色素A的含量［J］.中國民族醫(yī)藥雜志， 2012， 2(2):57-58.

［13］ 周春紅， 黃海欣， 馬 杰.HPLC法測定痛經(jīng)寶顆粒中羥基紅花黃色素 A的含量［ J］.中國藥師， 2011， 14(8): 1231-1232.

［14］ 邱國慶， 黃海欣.HPLC法測定舒胸片中羥基紅花黃色素A的含量［J］.北方藥學， 2012， 9(3):8-9.

［15］ 張金霞.HPLC法測定乳痛丸中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］.中國藥事， 2012， 26(12):1363-1365.

Sim ultaneous determ ination of hydroxysafflor yellow A， ferulic acid and amm onium glycyrrhizinate in Xinshenghua Granules by RP-HPLC

ZHANG Jian-ye1， CHEN Xing1， SUN Yun-feng2
(1.Nanyang City in Henan Province Institute for Food and Drug Control， Nanyang 473061， China； 2.Basic Medical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China)

AIM To estahlish a RP-HPLCmethod for the simultaneous determination of hydroxysafflor yellow A， ferulic acid and ammonium glycyrrhizinate in Xinshenghua Granules(Angelicae sinensis Radix， Chuanxiong Rhizoma， Persicae Semen).METHODS RP-HPLC method was adopted with Agilent Eclipse XDB-C18colunm (250 mm×4.6 mm， 5 μm)and ofmethanol-acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution as the mobile phase in gradient elutionmode.The flow rate was1.0mL/min with UV detection wavelength at273 nm.RESULTS The calibration curves of hydroxysafflor yellow A， ferulic acid and ammonium glycyrrhizinatewere in a good linearity over the ranges of 5.302 4 ～106.047 4 μg/mL(r=0.999 9) ， 4.689 2 ～93.783 4 μg/mL(r=0.999 9)，3.5 ～70 μg/m L(r=0.999 9) ， respectively； the average recoveries and RSD(n=6)were 99.60%(RSD= 0.96%)， 99.32%(RSD=1.24%)， 99.83%(RSD=1.49%)， respectively.CONCLUSION Thismethod is accurate and reliable for the determination of above three constituents in Xinshenghua Granules.

hydroxysafflor yellow A； ferulic acid； ammonium glycyrrhizinate； Xinshenghua Granules；RP-HPLC

R927.2

:A

:1001-1528(2014)02-0310-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.020

2012-04-07

張建業(yè) (1957—) ， 男， 主管藥師， 從事藥品檢驗和質(zhì)量控制研究。 Tel:13837729364， E-mail:nyzhangjiangye@126.com