王夢(mèng)穎周登博井濤胡一鳳高祝芬謝晴宜張錫炎戚春林

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570028；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，?？?571101；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口試驗(yàn)站，海口 570102）

不同品種香蕉內(nèi)生菌分離及廣譜拮抗菌的篩選

王夢(mèng)穎1，2周登博2井濤3胡一鳳1，2高祝芬2謝晴宜2張錫炎2戚春林1

（1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570028；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，海口 571101；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？谠囼?yàn)站，海口 570102）

旨在探究抗病品種與易感品種香蕉的健康株和病株內(nèi)生菌與其中廣譜拮抗菌的主要分布規(guī)律，并對(duì)廣譜拮抗菌進(jìn)行拮抗活性的測(cè)定。以樣品根、球莖、假莖、葉為材料分離培養(yǎng)內(nèi)生菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下，篩選對(duì)供試的10種香蕉致病菌均有良好拮抗活性的菌株并測(cè)定它們的拮抗活性，對(duì)活性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列同源性分析。結(jié)果顯示，分離得到內(nèi)生菌438株，其中細(xì)菌240株，放線(xiàn)菌142株，真菌56株?？共∑贩N南天黃病株中分離得到的內(nèi)生菌最多，共計(jì)128株。內(nèi)生菌數(shù)量在香蕉植株中的分布呈現(xiàn)規(guī)律為：根部＞球莖部＞假莖部＞葉部。內(nèi)生真菌在各香蕉種病株中的分布最廣泛。篩選出具廣譜活性的放線(xiàn)菌10株、細(xì)菌2株。其中內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株041的廣譜拮抗活性最強(qiáng)，最大抑菌帶寬為28.13±1.89 mm。對(duì)廣譜拮抗內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株041、04-1、19-1、03A-1進(jìn)行的形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析表明，它們屬于鏈霉菌屬。

香蕉 內(nèi)生菌 廣譜拮抗菌 分離

香蕉是世界貿(mào)易量及消費(fèi)量最大宗的鮮果，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）定位為發(fā)展中國(guó)家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物［1］，是我國(guó)南方四大名果之一，也是我國(guó)內(nèi)消費(fèi)和出口創(chuàng)匯的重要資源，經(jīng)濟(jì)地位極其重要。海南是香蕉的主產(chǎn)區(qū)，香蕉是其優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，在其水果種植業(yè)中占有很重要的位置［2］。然而香蕉種植區(qū)氣候普遍潮濕高溫，易發(fā)生病害，多發(fā)的香蕉病害輕則造成香蕉果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量降低，重則對(duì)香蕉的生產(chǎn)造成毀滅性打擊。由于大量頻繁使用農(nóng)藥會(huì)破壞生態(tài)平衡、增加香蕉果實(shí)內(nèi)農(nóng)藥的殘留量，因此尋找有效的控制香蕉病害的生防菌對(duì)于香蕉生產(chǎn)十分重要。

植物內(nèi)生菌是在植物組織內(nèi)與植物共生的一類(lèi)微生物，它們具有在植物體內(nèi)獨(dú)立自主地分裂繁殖和傳遞的特性，成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌，因此分離并利用作物的內(nèi)生菌控制作物的病蟲(chóng)害、開(kāi)發(fā)有益內(nèi)生菌以提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)于可持續(xù)性農(nóng)業(yè)具有重要意義［3，4］。本研究采用嚴(yán)格的表面消毒程序，從健康與感病香蕉的根、球莖、假莖、葉內(nèi)部分離出內(nèi)生細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌，并且針對(duì)微生物農(nóng)藥具有單一性的不足，從廣譜拮抗方面對(duì)香蕉內(nèi)生菌進(jìn)行篩選，旨在為這些內(nèi)生菌株的進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 海南省臨高縣南保鎮(zhèn)、皇桐鎮(zhèn)蕉園采集易感品種巴西蕉、抗病品種農(nóng)科一號(hào)、抗病品種南天黃健康株和病株的根、球莖、假莖、葉。1.1.2 供試病原菌 香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.Cubense）4號(hào)生理小種（FOC4）和1號(hào)生理小種（FOC1）、香蕉大灰斑病菌（Curvularia lunata）、香蕉長(zhǎng)形斑病菌（Curvularia fallax）、香蕉棒孢霉落葉病菌［Corynespora cassiicola（Berk&Curt）Wei］、香蕉葉緣枯斑病菌（Alternaria musae）、香蕉果尖腐爛病菌（Deightoniella troulosa）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、粉蕉葉枯病菌（Pestalogiopsissp.）、香蕉樹(shù)木潰瘍病菌（Btoryosphaeria dothidea），均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基，Yeast Extract with supplements（YE）培養(yǎng)基，Potato Dextrose Agar（PDA）培養(yǎng)基，馬丁培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 香蕉各組織內(nèi)生菌選擇性分離培養(yǎng)

1.2.1.1 樣品表面消毒與檢測(cè) 采用改進(jìn)的阮繼生［6］的樣品表面消毒方法，表面消毒檢測(cè)采用常規(guī)印跡法［7］。

1.2.1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化與保藏 無(wú)菌研磨樣品后無(wú)菌水震蕩過(guò)夜，取10-4和10-5稀釋液涂布于LB平板，選取代表菌劃線(xiàn)純化，挑取單菌落于LB斜面上和終濃度為20%的甘油中，保藏于-80℃。

1.2.1.3 內(nèi)生放線(xiàn)菌的分離、純化與保藏 無(wú)菌研磨處理樣品，然后分別加入3 mL預(yù)培養(yǎng)液（N-ZAmine 0.2 g/L的pH7.0磷酸鹽緩沖液）震蕩培養(yǎng)后涂布于分離平板［6］1/10ATCC172、SIM、HV、GA、GPT、高氏培養(yǎng)基。代表菌株采用三步劃線(xiàn)法［3］劃線(xiàn)到Y(jié)E平板上獲得單菌落，于YE培養(yǎng)基斜面上劃線(xiàn)接種，保藏于-80℃。

1.2.1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化與保藏 無(wú)菌研磨樣品取10-3和10-4稀釋液涂布于馬丁培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出后選取代表菌株劃線(xiàn)到PDA平板上，挑取單菌落于PDA培養(yǎng)基斜面上劃線(xiàn)接種，保藏于-80℃。

1.2.2 內(nèi)生菌株的廣譜拮抗活性測(cè)定

1.2.2.1 廣譜活性菌株的篩選 香蕉枯萎病FOC4拮抗菌的初篩采用平板對(duì)峙法［7］，再以香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、香蕉長(zhǎng)形斑病菌、香蕉棒孢霉落葉病菌、香蕉葉緣枯斑病菌等9株香蕉病原真菌為靶標(biāo)菌，用平板對(duì)峙劃線(xiàn)法［8］對(duì)初篩菌株進(jìn)行廣譜拮抗活性測(cè)定。

1.2.2.2 廣譜拮抗菌株抗香蕉枯萎病FOC4活性測(cè)定 采用澆混平板法［9］，用黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基［10］震蕩培養(yǎng)一周，將10%的上清濾液加入PDA培養(yǎng)基均勻混合，倒入平板，在每個(gè)平板中接入FOC4菌塊，發(fā)酵液活性高的菌株將會(huì)抑制病原菌的生長(zhǎng)。

采用孢子萌發(fā)法［11］，在無(wú)菌條件下將FOC4孢子懸液用無(wú)菌水稀釋到1×107CFU/mL，按發(fā)酵液與FOC4孢子懸液1∶1混合至凹玻片內(nèi)混勻，以液體PDA培養(yǎng)基處理為對(duì)照，對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)80%時(shí)觀察孢子萌發(fā)情況。

孢子萌發(fā)率（%）=［（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率］×100%

1.2.3 菌株041、04-1、19-1、03A-1的形態(tài)學(xué)鑒定與16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用平板插片法［8］并加以改進(jìn)，用掃面電子顯微鏡觀察孢子形態(tài)。

1.2.3.2 16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建菌株041、04-1、19-1、03A-1的基因組DNA提取并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為細(xì)菌的16S rDNA通用引物。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司完成序列測(cè)定。測(cè)定的序列在GenBank中做BLAST比較，選取相似序列與目標(biāo)序列比對(duì)，生成MEGA5.05格式文件，用生成的多序列比對(duì)結(jié)果文件構(gòu)建Neighbor-Joining樹(shù)，并進(jìn)行Bootstrap分析。

2 結(jié)果

2.1 香蕉各組織內(nèi)生菌選擇性分離培養(yǎng)

表面消毒檢測(cè)：將印跡平板于28℃下培養(yǎng)2周后觀察無(wú)菌生長(zhǎng)，證實(shí)分離到的438株代表菌株均為內(nèi)生菌。

2.1.1 不同香蕉品種內(nèi)生菌分布 如圖1所示，內(nèi)生菌分布最多在抗病品種南天黃病株中，共計(jì)128株；其次分布最多在易感品種巴西蕉健康株中，共計(jì)118株；分布最少在抗病品種農(nóng)科一號(hào)中，共計(jì)49株。內(nèi)生菌數(shù)量在各品種中的分布呈現(xiàn)南天黃病株＞巴西蕉健康株＞巴西蕉病株＞南天黃健康株＞農(nóng)科一號(hào)健康株的規(guī)律。此外，易感品種巴西蕉健康株的內(nèi)生菌多于病株，而抗病品種南天黃病株的內(nèi)生菌多于健康株。

2.1.2 各組織中內(nèi)生菌分布 以分離的菌株形態(tài)特征、顏色特征和表面紋理各不相同的代表菌株為統(tǒng)計(jì)分析依據(jù)。各組織內(nèi)生菌的數(shù)量與種類(lèi)分布總體呈現(xiàn)根部＞球莖部＞假莖部＞葉部的規(guī)律。如圖2所示，5個(gè)香蕉品種中，南天黃病株各組織的內(nèi)生菌數(shù)量變化差異最顯著，如在內(nèi)生菌分布最豐富的根組織中，南天黃病株的內(nèi)生菌最多，共61株，但其葉中內(nèi)生菌僅6株；巴西蕉健康株的內(nèi)生菌在根部共計(jì)36株、球莖39株、假莖19株、葉部26株，可見(jiàn)其內(nèi)生菌分布相對(duì)豐富且各部位總體呈現(xiàn)均勻分布；巴西蕉病株內(nèi)生菌雖相對(duì)較少，但各組織內(nèi)生菌也呈現(xiàn)均勻分布?？共∑贩N農(nóng)科一號(hào)健康株根部?jī)?nèi)生菌共35株，也與莖（4株）、葉（3株）內(nèi)生菌分布數(shù)量差異顯著。

2.1.3 內(nèi)生細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌在各香蕉品種間的分布 試驗(yàn)結(jié)果表明，香蕉的根、球莖、假莖、葉中均有內(nèi)生細(xì)菌、放線(xiàn)菌和真菌的存在。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)，共分離得到438株內(nèi)生菌，其中細(xì)菌數(shù)量最多，其次是放線(xiàn)菌，真菌最少。內(nèi)生細(xì)菌在巴西蕉健康株中分布最多（圖3-A），內(nèi)生放線(xiàn)菌在南天黃病株中分布最多（圖3-B）。內(nèi)生真菌大多為致病菌，其在巴西蕉病株數(shù)量最多（圖3-C），且各香蕉品種中的內(nèi)生真菌數(shù)量在健康株與病株中呈現(xiàn)病株多于健康株的分布。如圖3-A所示，內(nèi)生細(xì)菌共計(jì)240株，占內(nèi)生菌分離總數(shù)的55%。其中巴西蕉健康株中分布最多，共67株；農(nóng)科一號(hào)健康株中分布最少，共23株。從各組織分布看，內(nèi)生細(xì)菌在植株根中分布最多，共78株；假莖中分布最少，共46株。此外，易感品種巴西蕉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分布是健康株＞病株，而抗病品種南天黃中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分布是健康株＜病株。通過(guò)ATCC、SIM、HV、GA、GPT和高氏一號(hào)培養(yǎng)基選擇性分離培養(yǎng)，共分離內(nèi)生放線(xiàn)菌142株，占內(nèi)生菌總數(shù)的32%。如圖3-B所示，南天黃病株中分布最多，共51株；巴西蕉病株中分布最少，共7株。從組織分布看，內(nèi)生放線(xiàn)菌在植株根組織中分布最多，共68株；葉組織分布最少，共7株。此外，易感品種巴西蕉內(nèi)生放線(xiàn)菌數(shù)量分布呈現(xiàn)健康株＞病株的現(xiàn)象，而從抗病品種南天黃

2.2 內(nèi)生菌株的廣譜拮抗活性測(cè)定

2.2.1 廣譜拮抗菌株的篩選 篩選出具有較好抗香蕉枯萎病FOC4的活性菌株29株，抑菌率最大可達(dá)到98%，占內(nèi)生菌分離總數(shù)的7%。其中放線(xiàn)菌15株，細(xì)菌12株，真菌有2株具有抑菌活性，但效果不顯著。篩選出對(duì)香蕉炭疽病、香蕉果尖腐爛病等9種香蕉致病真菌具有廣譜拮抗活性菌株12株。這些拮抗菌主要分布于易感品種巴西蕉健康株和抗病品種南天黃病株的根部與莖部（表1）。

表2顯示，內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株04-1、041、19-1和03A-1抑菌活性顯著，抑菌寬度最大為28.7 mm，抑菌率最高為98%；菌株19-1和03A-1均對(duì)香蕉棒孢霉落葉病Cc-013的抑菌活性顯著，但19-1對(duì)粉蕉葉枯病A-1和香蕉枯萎病FOC1抑菌活性弱且差異顯著，03A-1對(duì)香蕉長(zhǎng)形斑病L-1的抑菌活性弱，抑菌寬度僅為1.40±1.25 mm；菌株04-1和041對(duì)香蕉大灰斑病CW抑菌活性顯著，并且廣譜抑菌活性總體大于菌株19-1與菌株03A-1。健康株共分離內(nèi)生放線(xiàn)菌12株，從其病株中卻分離到51株，遠(yuǎn)比健康株豐富。如圖3-C所示，內(nèi)生真菌共計(jì)56株，占內(nèi)生菌分離總數(shù)的13%。其中，巴西蕉病株中分布最多，共21株；南天黃健康株和農(nóng)科一號(hào)健康株中分布最少，共6株。從組織分布看，內(nèi)生真菌在假莖中分布最多，共計(jì)23株；球莖中分布最少，共計(jì)3株。此外，易感品種巴西蕉和抗病品種南天黃的內(nèi)生真菌數(shù)量分布都呈現(xiàn)健康株＜病株的現(xiàn)象。

2.2.2 廣譜拮抗菌株抗香蕉枯萎病FOC4的活性測(cè)定 廣譜拮抗菌041、04-1、19-1和03A-1的發(fā)酵濾液對(duì)FOC4均有明顯抑菌效果，其中04-1和041對(duì)FOC4的菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑最大為25.80 mm。孢子萌發(fā)法測(cè)定發(fā)現(xiàn)4株菌的發(fā)酵濾液對(duì)FOC4的孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制效果。發(fā)酵濾液與FOC4孢子懸液的體積比為1∶1時(shí)，F(xiàn)OC4的孢子萌發(fā)率最低，僅為9.85%。

2.3 菌株041、04-1、19-1、03A-1的形態(tài)學(xué)鑒定與16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察（圖4）發(fā)現(xiàn)，菌株19-1孢子鏈直，孢子排列緊密整齊，孢子呈柱形或卵圓形，中央凹陷；菌株041和041孢子鏈呈緊密螺旋形，孢子球形或長(zhǎng)圓形，中央凹陷；菌株03A-1孢子鏈直，孢子橢圓形至短柱形，中央凹陷。

2.3.2 16S rDNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將菌株041、04-1、19-1和03A-1分別進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)序，其GenBank登錄號(hào)依次為：KF703552、KF703550、KF703551和KF703549。在EzTaxon與GenBank上進(jìn)行序列相似性分析，用MEGA 5.05中Neighbor-Joining法比較同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖5）顯示，菌株Streptomycessp. 19-1靠近Streptomyces antibioticu（同源性為98.34%）；Streptomycessp. 041和Streptomycessp. 04-1都與S. phaeoluteichromatogenes和S. misionensis靠近，同源性分別是98.89%和98.14% 與98.60%和98.72%；Streptomycessp. 03A-1靠近Streptomyces cellostaticus（98.25%）、Streptomyces yokosukanensis（98.10%）和Streptomyces griseochromogenes（98.23%），但與S. griseoruber同源性最高（98.76%）。16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些菌株均屬于鏈霉菌屬。它們確切的分類(lèi)地位需要進(jìn)一步的試驗(yàn)，如DNA-DNA雜交確定。

3 討論

香蕉枯萎病是一種土傳病害［14］，也是香蕉最重要的病害，曾在中、南美洲毀滅大片蕉園。該病害現(xiàn)廣泛分布于南太平洋、亞洲、澳大利亞、非洲、及美洲熱帶的香蕉產(chǎn)區(qū)［15］，我國(guó)廣東、廣西、福建、臺(tái)灣［16］和海南［17］等?。▍^(qū)）均有分布，災(zāi)害慘重。其中，香蕉枯萎病4號(hào)生理小種即FOC4自1967年在我國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)后，短短的10年時(shí)間內(nèi)，幾乎摧毀了臺(tái)灣的香蕉產(chǎn)業(yè)，使臺(tái)灣香蕉栽培面積自高峰時(shí)期的50 000 hm2銳減到20世紀(jì)90年代的6 000 hm2左右［26］。本研究以?xún)?nèi)生菌對(duì)香蕉枯萎病菌FOC4拮抗活性作為初篩標(biāo)準(zhǔn)，篩選出抗FOC4的活性菌株，接著再對(duì)這些菌株做包括香蕉枯萎病FOC1在內(nèi)的其它9種香蕉致病菌的廣譜拮抗活性篩選，并對(duì)篩選出的廣譜活性菌再一次做抗FOC4活性測(cè)定，旨在選擇對(duì)香蕉枯萎病有較好拮抗活性的廣譜性拮抗菌。采用香蕉內(nèi)生菌作為篩選生防菌的對(duì)象，因其本身就存在于香蕉體內(nèi)，容易占據(jù)有利的生防位置，可以經(jīng)受住植物自身的防衛(wèi)反應(yīng)，與病菌直接相互作用，從而給植物提供全面有效的保護(hù)［27］。最終篩選出的12株內(nèi)生廣譜拮抗菌對(duì)10種香蕉病原菌均有較好的抑菌活性，其中編號(hào)為041、04-1、19-1和03A-1的內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)香蕉枯萎病菌抑菌活性最強(qiáng)。目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的8 000多種微生物活性物質(zhì)中，有近70%是放線(xiàn)菌產(chǎn)生的，放線(xiàn)菌是產(chǎn)生抗生素的主要生物類(lèi)群。一般來(lái)說(shuō)，放線(xiàn)菌產(chǎn)生的抗生素都有強(qiáng)大的抗菌力，起抗菌作用的抗生素許多是廣譜的，有的還有抗霉菌的作用［3］。在本試驗(yàn)中，共選用6種放線(xiàn)菌的選擇性分離培養(yǎng)基以確保分離盡可能豐富的放線(xiàn)菌。雖然分離結(jié)果顯示內(nèi)生細(xì)菌為香蕉植株的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌，但最后經(jīng)篩選的活性較強(qiáng)的4株廣譜拮抗菌均為放線(xiàn)菌鏈霉菌屬。迄今已發(fā)現(xiàn)能抑制作物病原菌的放線(xiàn)菌素28種，其中13種已商品化生產(chǎn)，2種正處于試產(chǎn)階段［28］。本研究對(duì)具活性的內(nèi)生放線(xiàn)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定，旨在進(jìn)一步對(duì)其開(kāi)發(fā)利用。

香蕉不同品種對(duì)香蕉枯萎病具有不同的抗性。這種抗性是否與抗感品種的內(nèi)生菌有關(guān)，以及抗感品種間是否存在內(nèi)生菌多樣性和種群結(jié)構(gòu)的差異，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)不同抗感品種、以及植株各部位內(nèi)生菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的了解，對(duì)于香蕉病害的發(fā)生和防控具有重要的意義。本研究結(jié)果表明，內(nèi)生菌數(shù)量在各品種中的分布呈現(xiàn)南天黃病株＞巴西蕉健株＞巴西蕉病株＞南天黃健株＞農(nóng)科一號(hào)健株的規(guī)律?？偟膩?lái)說(shuō)不同寄主植物的抗病機(jī)理有3種：形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的物理抗病性（physical resistance）、生理生化方面的化學(xué)抗病性（chemical resistance），或者是兩者相互作用的共同抗病性［19］。其中，在化學(xué)抗病方面，主要研究集中在寄主受到病原菌侵染后體內(nèi)一系列的酶促反應(yīng)的進(jìn)行上。本試驗(yàn)中抗病品種南天黃的病株內(nèi)生菌為124株，是內(nèi)生菌分布數(shù)量最多的品種，并且其內(nèi)生菌數(shù)量是健康株中的一倍。分離還發(fā)現(xiàn)，南天黃病株根部與葉部的內(nèi)生菌數(shù)量懸殊，且具拮抗活性的菌株均集中在南天黃病株的根部，這可能就是由于抗病品種的抗病性在土壤習(xí)居病原菌侵入根部后產(chǎn)生的一系列化學(xué)反應(yīng)，致使植株體內(nèi)微生物數(shù)量增加，其中根部最多。此外，結(jié)果對(duì)比還發(fā)現(xiàn)易感品種巴西蕉健康株中的內(nèi)生菌數(shù)量為118株，在各品種內(nèi)生菌分布數(shù)量上位居第二，并且其健康株中的內(nèi)生菌數(shù)量要遠(yuǎn)多于病株。從植物微生態(tài)角度分析，植物微群落中，微種群數(shù)量越多則多樣性越高，植物生態(tài)系的功能與結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越不易感?。?5］。另外，內(nèi)生菌數(shù)量在樣品香蕉中的整體分布呈現(xiàn)：根部＞球莖部＞假莖部＞葉部，該結(jié)果與付業(yè)勤［12］的報(bào)道基本一致，所不同之處在于本研究對(duì)香蕉植株的球莖組織也進(jìn)行了分離處理，更全面地反映了香蕉內(nèi)生菌在各組織中的分布情況。此外，劉云霞［13］的研究結(jié)果也表明，根系統(tǒng)是內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植物的入口，因此聚集的內(nèi)生細(xì)菌較多，并通過(guò)輸導(dǎo)系統(tǒng)由莖部到葉部，可見(jiàn)內(nèi)生細(xì)菌多集中在輸導(dǎo)系統(tǒng)。從分離到的內(nèi)生菌來(lái)看，不同香蕉品種、不同的部位，分離到的菌株數(shù)量不同，也表明內(nèi)生菌在不同的植物體內(nèi)定殖情況不一。這可能是由于植物體內(nèi)是個(gè)微生態(tài)環(huán)境，寄主植物的改變?nèi)菀讓?duì)體內(nèi)微生物種群動(dòng)態(tài)造成影響；另外，植物本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布，內(nèi)生菌的侵入途徑等對(duì)分離結(jié)果也有一定的影響。史建榮等［19］報(bào)道的關(guān)于植物病原真菌致病性分析的研究中闡述了真菌是一類(lèi)能引起多種植物病害的病原微生物，存在于植株中的真菌大多有不同程度的致病性。本試驗(yàn)結(jié)果中，抗病品種和易感品種香蕉內(nèi)生真菌的分布數(shù)量均表現(xiàn)為病株多于健康株。

4 結(jié)論

從不同香蕉品種的不同部位共分離得到內(nèi)生菌438株，其中細(xì)菌240株，放線(xiàn)菌142株，真菌56株，故細(xì)菌是香蕉內(nèi)生菌中的優(yōu)勢(shì)種群。內(nèi)生菌數(shù)量在各品種中的分布呈現(xiàn)南天黃病株＞巴西蕉健株＞巴西蕉病株＞南天黃健株＞農(nóng)科一號(hào)健株的規(guī)律。抗病品種南天黃病株中分離得到的內(nèi)生菌最多，共計(jì)128株，抗病品種南天黃健康株內(nèi)生菌數(shù)量少于病株，而易感品種巴西蕉健康株內(nèi)生菌數(shù)量多于病株。內(nèi)生菌數(shù)量在香蕉各組織中的分布呈現(xiàn)規(guī)律為：根部＞球莖部＞假莖部＞葉部。內(nèi)生真菌在各品種病株中的分布最廣泛。篩選出具廣譜活性的放線(xiàn)菌10株、細(xì)菌2株。其中內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株041的廣譜拮抗活性最強(qiáng)，最大抑菌帶寬為28.13±1.89 mm。對(duì)廣譜拮抗內(nèi)生放線(xiàn)菌菌株041、04-1、19-1、03A-1進(jìn)行的形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析表明，它們屬于鏈霉菌屬，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Endophytes Isolation and Broad-spectrum Antagonistic Bacterias Screening from Banana

Wang Mengying1，2Zhou Dengbo2Jing Tao3Hu Yifeng1，2Gao Zhufen2Xie Qingyi2Zhang Xiyan2Qi Chunlin1
（1. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570028；2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，China Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；3. Institute of Banana and Plantain，China Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102）

In order to determine the main distribution of endophytes and their broad-spectrum antimicrobial activity, endophytes were obtained from healthy and diseased tissues of two disease-resistant and one disease susceptible banana cultivars. Endophytes were separated from roots, corms, pseudostems, leaves and store in the ultra-low on Luria-Bertani（LB）, Yeast Extract with supplements（YE）, and Potato Dextrose Agar（PDA）strain store medium. Then screened broad-spectrum antagonistic bacteria which againstFusarium oxysporumf. sp. Cubense,Curvularia lunata,Curvularia fallax,Corynespora cassiicola（Berk & Curt）Wei,Alternaria musae,Deightoniella troulosa,Colletotrichum musae,Pestalogiopsissp.,Btoryosphaeria dothidea. Taxonomy identification of 041, 04-1, 19-1, 03A-1 was conducted by evaluating morphologic characteristics and 16S rDNA gene sequences for phylogenetic analysis. After purification, total of 438 endophytes were obtained. The total of isolates showed that we obtained 240 strains bacteria, followed by 142 strains actinomycetes, and 56 strains fungi. The richest number of endophytes that isolated from diseased NanTian banana cultivars（128）. Ten actinomyces and two bacterias were determined to possess antibiotic activity against Ten banana pathogens. Isolates 041 was the most effective and had 28.13±1.89 mm width of inhibition zone. Isolated 041, 04-1, 19-1, 034-1 were identified asStreptomyces misionensis.

Banana Endophytes Broad-spectrum antagonistic bacteria Isolation

2014-01-03

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目專(zhuān)項(xiàng)（CARS-32）

王夢(mèng)穎，碩士，研究方向：生態(tài)學(xué)；E-mail：403151373@qq.com

戚春林，博士，副教授，研究方向：生態(tài)學(xué)；E-mail：chunlinqu@163.com