馮丹寧德魯陳少瑜李勇杰張艷麗吳濤陳海云

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室，昆明 650201）

正交試驗(yàn)優(yōu)化八角ISSR-PCR反應(yīng)體系

馮丹1，2寧德魯1陳少瑜1，2李勇杰1張艷麗1吳濤1，2陳海云1

（1.云南省林業(yè)科學(xué)院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室，昆明 650201）

利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物（UBC 886）、dNTP、Mg2+濃度5個(gè)因素對云南八角ISSR-PCR反應(yīng)的影響，建立其最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明：25 μL的反應(yīng)體系中5個(gè)因子的最佳水平為：Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，40次循環(huán)；72℃最后延伸7 min，4℃保存。

八角 ISSR-PCR反應(yīng) 正交設(shè)計(jì) 體系優(yōu)化

八角（Illicium verumHook. f.）是我國南方重要經(jīng)濟(jì)林木之一，其干果和茴油為我國傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品。同時(shí)，八角中的莽草酸是制造抗病毒藥物奧司他韋的合成原料之一，特別用于流感的防治，2009年的H1N1新流感及2013年H7N9流感亦使用奧司他韋作治療［1］。中國八角干果90%來自廣西和云南，截至2011年底，全國八角干果年產(chǎn)量13.32萬t，而廣西、云南產(chǎn)量總和占全國總產(chǎn)量的93.62%［2］。因而，發(fā)展八角產(chǎn)業(yè)，對推動(dòng)西部暖濕山區(qū)農(nóng)民致富，改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。云南八角種質(zhì)資源極為豐富，實(shí)生群體分布廣泛，在早實(shí)、豐產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗性好的果實(shí)品質(zhì)等方面具有豐富的多樣性。這些豐富的種質(zhì)資源不僅是新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是八角產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)?？茖W(xué)合理地保護(hù)開發(fā)和利用這些豐富的種質(zhì)資源，對八角產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

我國學(xué)者已從形態(tài)特征及分布、良種選育、栽培管理和病蟲害防治等方面對八角做了大量研究工作［3-5］，利用分子生物技術(shù)對八角展開研究是近一年來才開始的，且僅限于用AFLP［6］和RAPD［7］進(jìn)行八角遺傳多樣性分析。簡單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記（ISSR）是一種在PCR中直接使用微衛(wèi)星序列進(jìn)行DNA擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)［8］。由于ISSR技術(shù)具備操作簡單、快速、高效、重復(fù)性好、耗資低等特點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因鑒定和植物分類等各方面工作［9］。但是，對于不同的物種，反應(yīng)體系的各因子的濃度將影響擴(kuò)增結(jié)果?；诖?，本試驗(yàn)選擇云南省不同地區(qū)的八角作為試驗(yàn)材料，采用正交設(shè)計(jì)對反應(yīng)體系中Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs等5個(gè)因子進(jìn)行試驗(yàn)和分析，旨在摸索出一個(gè)適合八角ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，為八角今后相關(guān)的分子遺傳分析工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來源于云南省文山州麻栗坡縣、廣南縣和富寧縣3個(gè)居群。DNA提取參照陳海云［10］的方法。用微量紫外分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進(jìn)行檢測，根據(jù)DNA模板濃度梯度稀釋結(jié)果［11］，DNA模板濃度調(diào)至2×10-3ng/μL。隨機(jī)從以上4個(gè)居群中分別取出兩個(gè)單株，等量混合后作為ISSR-PCR反應(yīng)的DNA模板。

TaqDNA聚合酶、MgCl2等試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的ISSR引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)引物初步篩選，選擇有擴(kuò)增產(chǎn)物但效果欠佳的UBC886（3'-VDVCTCTCTCTCTCTCT-5'）作為ISSR-PCR體系優(yōu)化引物。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR體系的正交設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用5因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［12］，TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物和DNA模板的各濃度梯度，見表1，正交試驗(yàn)共25個(gè)反應(yīng)體系（表2）。反應(yīng)總體積為25 μL，各體系中均加入2.5 μL的10×PCR buffer，其他各因素按表2加樣，用ddH2O補(bǔ)足25 μL，用20 μL滅菌礦物油覆蓋。

反應(yīng)在Bio Rad C1000 Touch PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次；72℃延伸7 min，12℃保存。

1.2.2 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序穩(wěn)定性檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為0.5×TBE，將擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)指示劑按照6∶1混合后取10 μL加入點(diǎn)樣孔，以5 μL的D2000（天根）為Marker，120 V恒壓電泳90 min，用Gene Genius Bio凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。用3個(gè)不同種源的12個(gè)云南八角單株檢測最佳反應(yīng)體系和程序的穩(wěn)定性。1.2.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)電泳圖為每個(gè)處理中的可識別條帶賦值，將有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，采用SPSS19.0進(jìn)行極差分析和方差分析，同時(shí)參考條帶的亮度和背景清晰度進(jìn)行判斷，選出最佳體系。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)分析

2.1.1 正交試驗(yàn)擴(kuò)增的電泳圖譜直觀分析 八角ISSR-PCR正交試驗(yàn)電泳圖如圖1所示，由于不同處理間Mg2+、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs濃度不同，ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果也有明顯的差異。處理組合2、4、17、18和24擴(kuò)增條帶明亮，背景較為清晰。其中處理組合2（A3B3C1D1E4）和4（A3B1C4D4E1）的擴(kuò)增主帶明亮，背景清晰，表明這兩個(gè)處理在八角ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中效果最佳。

2.1.2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 根據(jù)電泳圖為每個(gè)處理中的可識別條帶賦值（表2），將有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，然后對正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。極差分析中，Ki（i= 1，2，3和4）代表各因素同一水平下的條帶數(shù)之和，R表示同一因素不同水平間的極差值。極差值反映了每個(gè)因素對ISSR-PCR 反應(yīng)的影響程度，R值越大，說明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大。從極差R值可以看出，dNTPs和DNA模板對八角ISSR-PCR反應(yīng)的影響最大，極差值為25；其次是引物，極差值為18；Mg2+和TaqDNA聚合酶的極差值均小于空白組的極差值，分別為16和17。各因素的主效應(yīng)對八角ISSR-PCR反應(yīng)影響的順序?yàn)椋篸NTPs＞DNA模板＞引物＞TaqDNA聚合酶＞Mg2+濃度。

為進(jìn)一步確定各因素對八角ISSR-PCR反應(yīng)正交試驗(yàn)的影響，本試驗(yàn)利用SPSS19.0進(jìn)行了方差分析和多重比較。結(jié)果（表4）表明，Mg2+濃度和引物對試驗(yàn)結(jié)果的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而DNA模板、TaqDNA聚合酶和dNTPs對試驗(yàn)結(jié)果的影響未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。多重比較結(jié)果表明，Mg2+濃度在水平1時(shí)，擴(kuò)增條帶少且背景模糊，與其他3個(gè)水平間存在顯著差異，當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到2-4 mmol/L之間時(shí)，擴(kuò)增條帶較多，其中Mg2+濃度在3 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶明亮，背景清晰；引物濃度在0.6-0.8 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，擴(kuò)增條帶最多，結(jié)合主帶亮度和背景清晰度等方面考慮，引物的最適濃度為0.8 μmol/L；TaqDNA聚合酶在1.5-2.0 U時(shí)對正交試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，但是結(jié)合極差分析中各因素對正交試驗(yàn)結(jié)果影響的排序，TaqDNA聚合酶的最適濃度為0.5 U。綜上所述，在25 μL的八角ISSR-PCR體系中，5個(gè)因素的最佳組合為A3B1C4D4E1，即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L。

2.2 ISSR-PCR系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測

根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析得到最佳優(yōu)化體系（A3B1C4D4E1），隨機(jī)選擇12個(gè)八角單株（每個(gè)居群各4株）進(jìn)行擴(kuò)增，以便進(jìn)一步檢測該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。結(jié)果（圖2）表明，12個(gè)單株均能獲得清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的條帶，表明本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化八角ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。

3 討論

目前，八角分子標(biāo)記和基因序列方面的研究僅限于潘曉芳等［6］對八角屬8個(gè)種和八角47個(gè)品種（類型）進(jìn)行的AFLP遺傳多樣性分析，陳海云等［7］基于RAPD技術(shù)對云南23個(gè)八角優(yōu)良無性系進(jìn)行的遺傳多樣性分析，劉文倩等［14］用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列對披針葉八角（I. laceolatum）進(jìn)行的聚類分析。本研究初始根據(jù)已報(bào)道的八角屬的地楓皮（I. difengpi）［15］和黃花八角（I. parviflorum）［16］ISSR反應(yīng)體系建立八角ISSR-PCR試驗(yàn)體系時(shí)，未能得到理想的擴(kuò)增結(jié)果，先通過單因素試驗(yàn)［11］獲知八角DNA模板用量遠(yuǎn)低于普通ISSR-PCR反應(yīng)體系時(shí)方能得到較為滿意的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了理想的擴(kuò)增結(jié)果。

由于ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)的擴(kuò)增結(jié)果受引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+濃度和dNTPs濃度等多種因素的影響，且各因素間又可能存在互作效應(yīng)，因此確定最適八角ISSR-PCR體系就顯得尤為必要。前人研究表明，DNA模板為102-105拷貝數(shù)時(shí)有利于ISSR-PCR試驗(yàn)［13］，所以，當(dāng)本試驗(yàn)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)最終選用0.016 ng的DNA模板時(shí)，ISSR-PCR反應(yīng)取得了較好的擴(kuò)增效果。為獲得重復(fù)性好、可靠性高的擴(kuò)增譜帶，本試驗(yàn)還通過正交試驗(yàn)對影響八角ISSR-PCR反應(yīng)的其他4個(gè)因素Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、引物和dNTPs在4個(gè)不同的濃度水平上進(jìn)行了優(yōu)化。Mg2+和dNTPs是TaqDNA聚合酶活性所必需的因素，兩者之間能相互結(jié)合形成復(fù)合物，dNTPs濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，過高會(huì)造成浪費(fèi)，且會(huì)降低Mg2+的有效濃度［13］。此外，引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度也是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，二者濃度過高可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而濃度過低則會(huì)影響擴(kuò)增效果。總之，Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs各因素對PCR反應(yīng)的影響既獨(dú)立又互補(bǔ)。因此，今后在設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí)，不但應(yīng)兼顧各因素主效應(yīng)，同時(shí)還應(yīng)該考慮各因素間可能存在的交互作用，以便獲得條帶明亮、背景清晰、可靠性高的擴(kuò)增圖譜。

4 結(jié)論

通過直觀、極差、方差和多重比較，最終確定了處理4，即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L為最佳的水平組合。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Anise（Illicium verum Hook. f.）Based on Orthogonal Design

Feng Dan1，2Ning Delu1Chen Shaoyu1，2Li Yongjie1Zhang Yanli1Wu Tao1，2Chen Haiyun1
（1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201；2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Yunnan Laboratory for Conservation of Rare，Endangered & Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration，Kunming 650201）

Based on orthogonal design experiments, five main factors in ISSR-PCR amplification system, including Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, DNA template, primer（UBC 868）and dNTPs, were studied to optimize the system for Illicium verum Hook. f.. The results showed that the optimized system was a total volume of 25 μL containing 3 mmol/L Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.016 ng DNA template, 0.8 μmol/L primer and 0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was started with predegeneration at 94℃ for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds for denaturalization at 94℃, 45 seconds of annealing at 46℃, 60 seconds of extension at 72℃；7 minutes of extension at 72℃ and indefinitely remain at 4℃.

Illicium verum Hook. f. ISSR-PCR Orthogonal design Reaction system

2013-11-15

云南省“十一五”科技攻關(guān)項(xiàng)目（2006NG26），云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010ZC234）

馮丹，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：林木遺傳育種；E-mail：fengdan1220@hotmail.com

陳海云，女，副研究員，研究方向：經(jīng)濟(jì)林良種選育及栽培；E-mail：kmchenhy@163.com吳濤，男，博士，助理研究員，研究方向：林木遺傳育種；E-mail：ynafwt@126.com