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        正交試驗(yàn)優(yōu)化八角ISSR-PCR反應(yīng)體系

        2014-04-09 08:37:43馮丹寧德魯陳少瑜李勇杰張艷麗吳濤陳海云
        生物技術(shù)通報(bào) 2014年8期
        關(guān)鍵詞:條帶引物模板

        馮丹寧德魯陳少瑜李勇杰張艷麗吳濤陳海云

        (1.云南省林業(yè)科學(xué)院,昆明 650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室,昆明 650201)

        正交試驗(yàn)優(yōu)化八角ISSR-PCR反應(yīng)體系

        馮丹1,2寧德魯1陳少瑜1,2李勇杰1張艷麗1吳濤1,2陳海云1

        (1.云南省林業(yè)科學(xué)院,昆明 650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)試驗(yàn)室 國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)試驗(yàn)室,昆明 650201)

        利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+濃度5個(gè)因素對云南八角ISSR-PCR反應(yīng)的影響,建立其最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明:25 μL的反應(yīng)體系中5個(gè)因子的最佳水平為:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循環(huán);72℃最后延伸7 min,4℃保存。

        八角 ISSR-PCR反應(yīng) 正交設(shè)計(jì) 體系優(yōu)化

        八角(Illicium verumHook. f.)是我國南方重要經(jīng)濟(jì)林木之一,其干果和茴油為我國傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品。同時(shí),八角中的莽草酸是制造抗病毒藥物奧司他韋的合成原料之一,特別用于流感的防治,2009年的H1N1新流感及2013年H7N9流感亦使用奧司他韋作治療[1]。中國八角干果90%來自廣西和云南,截至2011年底,全國八角干果年產(chǎn)量13.32萬t,而廣西、云南產(chǎn)量總和占全國總產(chǎn)量的93.62%[2]。因而,發(fā)展八角產(chǎn)業(yè),對推動(dòng)西部暖濕山區(qū)農(nóng)民致富,改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。云南八角種質(zhì)資源極為豐富,實(shí)生群體分布廣泛,在早實(shí)、豐產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)、抗性好的果實(shí)品質(zhì)等方面具有豐富的多樣性。這些豐富的種質(zhì)資源不僅是新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ),同時(shí)也是八角產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)??茖W(xué)合理地保護(hù)開發(fā)和利用這些豐富的種質(zhì)資源,對八角產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

        我國學(xué)者已從形態(tài)特征及分布、良種選育、栽培管理和病蟲害防治等方面對八角做了大量研究工作[3-5],利用分子生物技術(shù)對八角展開研究是近一年來才開始的,且僅限于用AFLP[6]和RAPD[7]進(jìn)行八角遺傳多樣性分析。簡單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記(ISSR)是一種在PCR中直接使用微衛(wèi)星序列進(jìn)行DNA擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)[8]。由于ISSR技術(shù)具備操作簡單、快速、高效、重復(fù)性好、耗資低等特點(diǎn),近年來被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因鑒定和植物分類等各方面工作[9]。但是,對于不同的物種,反應(yīng)體系的各因子的濃度將影響擴(kuò)增結(jié)果?;诖?,本試驗(yàn)選擇云南省不同地區(qū)的八角作為試驗(yàn)材料,采用正交設(shè)計(jì)對反應(yīng)體系中Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs等5個(gè)因子進(jìn)行試驗(yàn)和分析,旨在摸索出一個(gè)適合八角ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系,為八角今后相關(guān)的分子遺傳分析工作奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)材料來源于云南省文山州麻栗坡縣、廣南縣和富寧縣3個(gè)居群。DNA提取參照陳海云[10]的方法。用微量紫外分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進(jìn)行檢測,根據(jù)DNA模板濃度梯度稀釋結(jié)果[11],DNA模板濃度調(diào)至2×10-3ng/μL。隨機(jī)從以上4個(gè)居群中分別取出兩個(gè)單株,等量混合后作為ISSR-PCR反應(yīng)的DNA模板。

        TaqDNA聚合酶、MgCl2等試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR引物序列,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)引物初步篩選,選擇有擴(kuò)增產(chǎn)物但效果欠佳的UBC886(3'-VDVCTCTCTCTCTCTCT-5')作為ISSR-PCR體系優(yōu)化引物。

        1.2 方法

        1.2.1 ISSR-PCR體系的正交設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用5因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12],TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物和DNA模板的各濃度梯度,見表1,正交試驗(yàn)共25個(gè)反應(yīng)體系(表2)。反應(yīng)總體積為25 μL,各體系中均加入2.5 μL的10×PCR buffer,其他各因素按表2加樣,用ddH2O補(bǔ)足25 μL,用20 μL滅菌礦物油覆蓋。

        反應(yīng)在Bio Rad C1000 Touch PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,循環(huán)40次;72℃延伸7 min,12℃保存。

        1.2.2 反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序穩(wěn)定性檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為0.5×TBE,將擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)指示劑按照6∶1混合后取10 μL加入點(diǎn)樣孔,以5 μL的D2000(天根)為Marker,120 V恒壓電泳90 min,用Gene Genius Bio凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。用3個(gè)不同種源的12個(gè)云南八角單株檢測最佳反應(yīng)體系和程序的穩(wěn)定性。1.2.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)電泳圖為每個(gè)處理中的可識別條帶賦值,將有條帶記為“1”,無條帶記為“0”,采用SPSS19.0進(jìn)行極差分析和方差分析,同時(shí)參考條帶的亮度和背景清晰度進(jìn)行判斷,選出最佳體系。

        2 結(jié)果

        2.1 正交試驗(yàn)分析

        2.1.1 正交試驗(yàn)擴(kuò)增的電泳圖譜直觀分析 八角ISSR-PCR正交試驗(yàn)電泳圖如圖1所示,由于不同處理間Mg2+、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs濃度不同,ISSR-PCR的擴(kuò)增結(jié)果也有明顯的差異。處理組合2、4、17、18和24擴(kuò)增條帶明亮,背景較為清晰。其中處理組合2(A3B3C1D1E4)和4(A3B1C4D4E1)的擴(kuò)增主帶明亮,背景清晰,表明這兩個(gè)處理在八角ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中效果最佳。

        2.1.2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 根據(jù)電泳圖為每個(gè)處理中的可識別條帶賦值(表2),將有條帶記為“1”,無條帶記為“0”,然后對正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析,結(jié)果見表3。極差分析中,Ki(i= 1,2,3和4)代表各因素同一水平下的條帶數(shù)之和,R表示同一因素不同水平間的極差值。極差值反映了每個(gè)因素對ISSR-PCR 反應(yīng)的影響程度,R值越大,說明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大。從極差R值可以看出,dNTPs和DNA模板對八角ISSR-PCR反應(yīng)的影響最大,極差值為25;其次是引物,極差值為18;Mg2+和TaqDNA聚合酶的極差值均小于空白組的極差值,分別為16和17。各因素的主效應(yīng)對八角ISSR-PCR反應(yīng)影響的順序?yàn)椋篸NTPs>DNA模板>引物>TaqDNA聚合酶>Mg2+濃度。

        為進(jìn)一步確定各因素對八角ISSR-PCR反應(yīng)正交試驗(yàn)的影響,本試驗(yàn)利用SPSS19.0進(jìn)行了方差分析和多重比較。結(jié)果(表4)表明,Mg2+濃度和引物對試驗(yàn)結(jié)果的影響達(dá)到顯著水平(P<0.05),而DNA模板、TaqDNA聚合酶和dNTPs對試驗(yàn)結(jié)果的影響未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。多重比較結(jié)果表明,Mg2+濃度在水平1時(shí),擴(kuò)增條帶少且背景模糊,與其他3個(gè)水平間存在顯著差異,當(dāng)Mg2+濃度達(dá)到2-4 mmol/L之間時(shí),擴(kuò)增條帶較多,其中Mg2+濃度在3 mmol/L時(shí),擴(kuò)增條帶明亮,背景清晰;引物濃度在0.6-0.8 μmol/L范圍內(nèi)時(shí),擴(kuò)增條帶最多,結(jié)合主帶亮度和背景清晰度等方面考慮,引物的最適濃度為0.8 μmol/L;TaqDNA聚合酶在1.5-2.0 U時(shí)對正交試驗(yàn)結(jié)果影響顯著,但是結(jié)合極差分析中各因素對正交試驗(yàn)結(jié)果影響的排序,TaqDNA聚合酶的最適濃度為0.5 U。綜上所述,在25 μL的八角ISSR-PCR體系中,5個(gè)因素的最佳組合為A3B1C4D4E1,即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L。

        2.2 ISSR-PCR系統(tǒng)穩(wěn)定性檢測

        根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析得到最佳優(yōu)化體系(A3B1C4D4E1),隨機(jī)選擇12個(gè)八角單株(每個(gè)居群各4株)進(jìn)行擴(kuò)增,以便進(jìn)一步檢測該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。結(jié)果(圖2)表明,12個(gè)單株均能獲得清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的條帶,表明本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化八角ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。

        3 討論

        目前,八角分子標(biāo)記和基因序列方面的研究僅限于潘曉芳等[6]對八角屬8個(gè)種和八角47個(gè)品種(類型)進(jìn)行的AFLP遺傳多樣性分析,陳海云等[7]基于RAPD技術(shù)對云南23個(gè)八角優(yōu)良無性系進(jìn)行的遺傳多樣性分析,劉文倩等[14]用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列對披針葉八角(I. laceolatum)進(jìn)行的聚類分析。本研究初始根據(jù)已報(bào)道的八角屬的地楓皮(I. difengpi)[15]和黃花八角(I. parviflorum)[16]ISSR反應(yīng)體系建立八角ISSR-PCR試驗(yàn)體系時(shí),未能得到理想的擴(kuò)增結(jié)果,先通過單因素試驗(yàn)[11]獲知八角DNA模板用量遠(yuǎn)低于普通ISSR-PCR反應(yīng)體系時(shí)方能得到較為滿意的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了理想的擴(kuò)增結(jié)果。

        由于ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)的擴(kuò)增結(jié)果受引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+濃度和dNTPs濃度等多種因素的影響,且各因素間又可能存在互作效應(yīng),因此確定最適八角ISSR-PCR體系就顯得尤為必要。前人研究表明,DNA模板為102-105拷貝數(shù)時(shí)有利于ISSR-PCR試驗(yàn)[13],所以,當(dāng)本試驗(yàn)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)最終選用0.016 ng的DNA模板時(shí),ISSR-PCR反應(yīng)取得了較好的擴(kuò)增效果。為獲得重復(fù)性好、可靠性高的擴(kuò)增譜帶,本試驗(yàn)還通過正交試驗(yàn)對影響八角ISSR-PCR反應(yīng)的其他4個(gè)因素Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、引物和dNTPs在4個(gè)不同的濃度水平上進(jìn)行了優(yōu)化。Mg2+和dNTPs是TaqDNA聚合酶活性所必需的因素,兩者之間能相互結(jié)合形成復(fù)合物,dNTPs濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量,過高會(huì)造成浪費(fèi),且會(huì)降低Mg2+的有效濃度[13]。此外,引物濃度和TaqDNA聚合酶濃度也是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,二者濃度過高可能產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,而濃度過低則會(huì)影響擴(kuò)增效果。總之,Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs各因素對PCR反應(yīng)的影響既獨(dú)立又互補(bǔ)。因此,今后在設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí),不但應(yīng)兼顧各因素主效應(yīng),同時(shí)還應(yīng)該考慮各因素間可能存在的交互作用,以便獲得條帶明亮、背景清晰、可靠性高的擴(kuò)增圖譜。

        4 結(jié)論

        通過直觀、極差、方差和多重比較,最終確定了處理4,即Mg2+濃度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L為最佳的水平組合。

        [1]寧德魯, 張雨, 陸斌, 等. 莽草酸高含量的八角優(yōu)良單株選擇研究[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2010, 39(3):43-46.

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        (責(zé)任編輯 狄艷紅)

        Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Anise(Illicium verum Hook. f.)Based on Orthogonal Design

        Feng Dan1,2Ning Delu1Chen Shaoyu1,2Li Yongjie1Zhang Yanli1Wu Tao1,2Chen Haiyun1
        (1. Yunnan Academy of Forestry,Kunming 650201;2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants,Yunnan Laboratory for Conservation of Rare,Endangered & Endemic Forest Plants,Public Key Laboratory of the State Forestry Administration,Kunming 650201)

        Based on orthogonal design experiments, five main factors in ISSR-PCR amplification system, including Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, DNA template, primer(UBC 868)and dNTPs, were studied to optimize the system for Illicium verum Hook. f.. The results showed that the optimized system was a total volume of 25 μL containing 3 mmol/L Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.016 ng DNA template, 0.8 μmol/L primer and 0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was started with predegeneration at 94℃ for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds for denaturalization at 94℃, 45 seconds of annealing at 46℃, 60 seconds of extension at 72℃;7 minutes of extension at 72℃ and indefinitely remain at 4℃.

        Illicium verum Hook. f. ISSR-PCR Orthogonal design Reaction system

        2013-11-15

        云南省“十一五”科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006NG26),云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010ZC234)

        馮丹,女,碩士,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:林木遺傳育種;E-mail:fengdan1220@hotmail.com

        陳海云,女,副研究員,研究方向:經(jīng)濟(jì)林良種選育及栽培;E-mail:kmchenhy@163.com吳濤,男,博士,助理研究員,研究方向:林木遺傳育種;E-mail:ynafwt@126.com

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