亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        p53基因及其功能研究進(jìn)展

        2014-04-09 07:03:48李文娟潘慶杰李美玉
        生物技術(shù)通訊 2014年2期
        關(guān)鍵詞:抗體基因蛋白

        李文娟,潘慶杰,李美玉

        青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物生殖發(fā)育與基因工程研究所,山東 青島 266109

        抑癌基因包括Rb基因、p53基因、NF-1基因、WT基因、結(jié)腸腺瘤性息肉(APC)基因和結(jié)腸癌缺失(DCC)基因等[1],其中前兩者為最重要且最為人了解的2個(gè)基因。自發(fā)現(xiàn)p53基因以來(lái),人們對(duì)該基因的認(rèn)識(shí)逐漸深入。p53基因家族包括p53、p63、p73基因。有研究顯示,在p53激活Bax、PARP通路和細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,TAp63和TAp73起重要作用,也就是說(shuō)p53、p63和p73之間存在相互作用。其中,p53基因在細(xì)胞應(yīng)激和腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用,該基因有DNA修復(fù)、阻滯細(xì)胞周期、抑制血管生成、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等作用。調(diào)查發(fā)現(xiàn),在人體發(fā)生的所有惡性腫瘤中,有一半以上會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變或缺失,說(shuō)明該基因在人類腫瘤的發(fā)生上有重要作用。因此,自1979年Lane[2]等發(fā)現(xiàn)該基因以來(lái),各國(guó)科學(xué)家對(duì)該基因及其功能進(jìn)行了大量研究。在此,我們簡(jiǎn)要闡述國(guó)內(nèi)外對(duì)p53基因及其編碼產(chǎn)物的研究現(xiàn)狀。

        1 p53基因的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

        1.1 p53基因的結(jié)構(gòu)

        人類p53基因位于17號(hào)染色體短臂1區(qū)31帶,即17p13.1,由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)顯子組成,其cDNA全長(zhǎng)2074 bp,有單一開放讀框,其中第1個(gè)外顯子不編碼,其上游400 bp處有啟動(dòng)子p1,下游1 kb處有啟動(dòng)子p2,兩者為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),第2、4、5、7、8外顯子分別編碼5個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域[3]。其下游基因主要包括 p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIPI、pig3、Cyclin G等[4],并直接影響了p53基因的多樣性。p53分為野生型和突變型,野生型p53為正常的p53基因,其突變方式包括點(diǎn)突變、缺失突變、移碼突變、基因重排等。野生型P53蛋白的半衰期很短,用免疫組化很難檢測(cè)到;而突變型P53蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變,半衰期延長(zhǎng),用免疫組化可以檢測(cè)出,因此當(dāng)檢測(cè)到組織中P53蛋白表達(dá)量高時(shí),可以判斷為突變型P53基因。P53蛋白主要包含3個(gè)功能區(qū)域,即N2末端轉(zhuǎn)錄區(qū)域(TAD)、C2末端寡居區(qū)域(OD)和核心區(qū)域(DBD)[5]。由于DBD可以結(jié)合特異序列的DNA,因此最為重要。

        研究發(fā)現(xiàn)p53基因的3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與雌激素代謝相關(guān)的腫瘤疾病有關(guān)聯(lián)[6]:p53基因第4外顯子72位密碼子具有GGT/CCT單核苷酸多態(tài)性,使編碼的精氨酸被脯氨酸取代,與多種腫瘤的易感性有關(guān);第3個(gè)內(nèi)含子區(qū)16 bp的插入序列5'-GACCTGGAG?GCTGGG-3'多態(tài)性,有該序列的等位基因是A',無(wú)該序列的為A,前者較罕見(jiàn);第6內(nèi)含子的MspⅠ限制性酶切位點(diǎn)G/A單核苷酸多態(tài)性,其中第一種與腫瘤相關(guān)性的研究最多。第4外顯子編碼的精氨酸和脯氨酸均為野生型,穩(wěn)定性相同,空間構(gòu)象和P53抗體的結(jié)合表位相似,但分子生物學(xué)行為和功能不完全相同。P53脯氨酸型蛋白與部分轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合較強(qiáng),可能更有效地激活轉(zhuǎn)錄,使下游基因表達(dá)上調(diào),而P53精氨酸型蛋白則能較好地抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以及對(duì)細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù)[7]。

        1.2 P53蛋白的作用機(jī)制

        p53基因轉(zhuǎn)錄生成全長(zhǎng)2.5 kb的mRNA,后者編碼的蛋白含393個(gè)氨基酸殘基,相對(duì)分子質(zhì)量為53×103。p53基因可調(diào)節(jié)大量靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞周期組織、凋亡、分化、靜息、DNA損傷、血管生成和轉(zhuǎn)移的抑制及其他功能[8]。

        野生型P53蛋白有抗細(xì)胞增殖的作用,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂,使其停留在G1期而不進(jìn)入S期。其作用機(jī)制為:由于野生型P53蛋白可通過(guò)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),為細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)酶修復(fù)損傷DNA爭(zhēng)取更多的時(shí)間,避免DNA突變?cè)谌旧w上的積累,如果損傷的DNA太嚴(yán)重而無(wú)法修復(fù)時(shí),P53會(huì)觸發(fā)凋亡系統(tǒng)調(diào)控受損細(xì)胞凋亡。野生型P53蛋白具有上調(diào)CDK抑制劑p21WAFI/CIPI基因轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而降低CDK的活性,不能磷酸化Rb進(jìn)而使細(xì)胞停留在G1/S期。該蛋白還可以與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)共同作用,降低DNA聚合酶的活性,使損傷細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程停止,進(jìn)而開始DNA的修復(fù)[9]。

        P53聯(lián)系著不同的細(xì)胞應(yīng)急和細(xì)胞應(yīng)答,受離子輻射、化學(xué)藥物及異常的細(xì)胞信號(hào)的刺激而得以表達(dá),表達(dá)升高后受到p53-mdm2、p14ARF-mdm2環(huán)路的精確調(diào)節(jié)。已開發(fā)出一種能干擾p53-MDM2復(fù)合物形成、促進(jìn)P53蛋白釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的類似P53蛋白的多肽[10]。而Svane等[11]已研制出結(jié)合了P53肽段的樹突細(xì)胞疫苗,臨床發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)增高,有三分之一的患者病情穩(wěn)定或輕度消退。

        2 p53基因表達(dá)的檢測(cè)

        通過(guò)對(duì)p53基因及其產(chǎn)物的監(jiān)測(cè),可以對(duì)腫瘤做出早期診斷和預(yù)測(cè),并且可以對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后做出科學(xué)推斷。

        2.1 納米探針檢測(cè)

        由于納米金顆粒具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)及較好的生物相容性,因此日益受到人們的關(guān)注[12]。1971年Faulk和Taylor[13]用免疫金與兔抗沙門菌抗血清結(jié)合檢測(cè)表面抗原,納米金作為一種免疫標(biāo)記技術(shù)開始快速發(fā)展。蘇州大學(xué)黃云艷的畢業(yè)論文中提到使用標(biāo)記了P53捕捉抗體的納米磁珠來(lái)富集和分離血清中的P53蛋白,然后用標(biāo)記了P53檢測(cè)抗體和HRP的納米金探針檢測(cè)已富集的P53蛋白。用IgG-Au-DNA-HRP型探針檢測(cè)P53蛋白,當(dāng)HRP分子和P53抗體的比例為2.5∶1時(shí)效果明顯。

        2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

        免疫組織化學(xué)法的原理就是利用特異性抗體與P53蛋白發(fā)生抗原抗體顯色反應(yīng),根據(jù)顯色斑點(diǎn)的有無(wú)和強(qiáng)弱,間接判斷P53蛋白的有無(wú)或多少。該方法得到了廣泛應(yīng)用[14-15],但不能大批量篩查樣本。

        2.3 利用同位素免疫檢測(cè)

        可以利用同位素標(biāo)記進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。放射性同位素標(biāo)記物的顯示具有高靈敏性,抗原抗體反應(yīng)具有高特異性,兩者結(jié)合起來(lái)檢測(cè)P53蛋白,精確性高,樣品用量少,且易規(guī)范化和自動(dòng)化[16]。

        2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

        有研究證明,用流式細(xì)胞儀可以雙參數(shù)分析P53蛋白和DNA的關(guān)系[17],該實(shí)驗(yàn)用DO-1單抗標(biāo)記P53蛋白,用PI染色DNA,結(jié)果證明可以用該方法測(cè)定P53蛋白。

        2.5 組織微陣列檢測(cè)

        組織微陣列又稱組織芯片,是將若干石蠟包埋塊上的各種典型組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新石蠟塊上重新構(gòu)建微型化高通量組織陣列的方法。用該方法可在一張玻璃板上排列成百上千個(gè)組織標(biāo)本,進(jìn)而研究組織標(biāo)本DNA、RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)??梢杂迷摲y(cè)定P53蛋白,具有數(shù)據(jù)量大、微型化、自動(dòng)化和節(jié)省勞動(dòng)力等優(yōu)點(diǎn)。

        2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

        酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的基本過(guò)程是將抗原(抗體)吸附于固相載體,在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng),底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。檢測(cè)P53蛋白可采用雙抗夾心法,原理仍然是抗原抗體特異反應(yīng),洗脫未結(jié)合部分,顯色顯示P53蛋白含量。實(shí)驗(yàn)證明該方法敏感性強(qiáng),特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性好[18]。但該方法有容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和操作繁瑣等缺點(diǎn)。

        3 p53基因的功能及應(yīng)用研究

        3.1 p53基因的功能

        p53基因的具有阻滯細(xì)胞周期的作用。p53基因可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G1和G2/M期校正點(diǎn)的監(jiān)測(cè),與轉(zhuǎn)錄激活功能密切相關(guān),p2IWAF/CIPI基因是p53的下游基因,該基因編碼的蛋白可以與一系列Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合,導(dǎo)致高磷酸化Rb蛋白堆積,進(jìn)而抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子活性,使G1期阻滯。

        p53基因還具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。p53基因可以通過(guò)Bax/Bcl-2、Fas/Apo1、IGF-Bp3等蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡,還可以通過(guò)死亡信號(hào)受體蛋白如TNF受體和Fas蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡。有學(xué)者認(rèn)為p53還可以直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基引發(fā)凋亡[19]。

        p53基因可以維持基因組穩(wěn)定。P53參與DNA的修復(fù)過(guò)程,切除錯(cuò)配核苷酸結(jié)合和調(diào)節(jié)核苷酸內(nèi)切修復(fù)因子的活性,如XPB因子和XPD因子。還可以利用自身3'→5'核酸外切酶活性與p21WAFI、GADD45和PCNA形成復(fù)合物發(fā)揮作用。

        p53基因可抑制腫瘤血管生成。當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定程度以后,能通過(guò)自分泌途徑形成促血管生成因子,刺激營(yíng)養(yǎng)血管在腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)增生。研究發(fā)現(xiàn)p53基因可調(diào)控下游多個(gè)基因的表達(dá),刺激抑制血管生成基因的表達(dá),進(jìn)而起到抑制腫瘤血管生成的作用,因此在各種腫瘤疾病的研究中發(fā)揮重要作用。

        3.2 p53基因在膽管癌中的研究

        對(duì)膽管癌的研究發(fā)現(xiàn),p53基因的突變均發(fā)生在高度保守區(qū),主要分布在CPG位點(diǎn),由G∶C向A∶T轉(zhuǎn)化。Head等[20]進(jìn)一步證實(shí)膽管癌細(xì)胞中的p53基因第272~282密碼子存在錯(cuò)義、插入及缺失突變。

        3.3 p53基因在肝癌中的研究

        研究證明,p53基因的突變與肝癌的病理密切相關(guān),突變率與肝癌分化呈負(fù)相關(guān)。此外,p53基因的表達(dá)還與腫瘤生長(zhǎng)與浸潤(rùn)有關(guān),有實(shí)驗(yàn)證明浸潤(rùn)性肝癌P53蛋白的表達(dá)顯著高于非浸潤(rùn)性。有研究發(fā)現(xiàn)p53基因249位點(diǎn)的突變與肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率、腫瘤包膜完整性、有無(wú)肝內(nèi)播散結(jié)點(diǎn)、是否為多發(fā)病灶等密切相關(guān)。

        3.4 p53基因在胃癌中的研究

        胃癌中最常突變的抑癌基因就是p53,不同類型及不同病因所致的胃癌患者,該基因的突變率不同。p53基因的突變和過(guò)表達(dá)發(fā)生在癌變的不同階段,在晚期胃癌和轉(zhuǎn)移者中更常發(fā)生,而不完全結(jié)腸化生和異型增生也有較高的檢出率。在腸型胃癌中,p53基因突變以無(wú)義突變、內(nèi)含子突變、沉默突變常見(jiàn),且突變率高于彌散性胃癌。此外,有萎縮性胃炎病史的患者,該基因的突變率也明顯較高。

        4 p53基因的研究前景

        自p53基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái),對(duì)該基因細(xì)胞調(diào)控方面的研究取得了一些進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)ONXY-015系統(tǒng)可以定位并殺死高表達(dá)p53變異基因的靶細(xì)胞,而且不損傷表達(dá)野生型的細(xì)胞。也有研究發(fā)現(xiàn)糖-膽固醇的去泛素化作用不僅可以通過(guò)增加p53的穩(wěn)定性而引發(fā)細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡,還可以激活p53家族通路。糖-膽固醇的去泛素化作用還可以激活Pinl,全面活化p53,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。

        對(duì)p53基因的研究開始應(yīng)用于癌癥的臨床治療上。用野生型p53基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞,可能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng),并且脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p53動(dòng)物模型已構(gòu)建成功,已開展通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的p53基因來(lái)治療惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn),p53可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療和熱療的敏感性,所以,如果利用該基因和傳統(tǒng)的化療等手段聯(lián)合使用,會(huì)取得較好的治療效果。腫瘤基因治療方法的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞最有效的途徑就是轉(zhuǎn)染那些失活的腫瘤抑制基因,而p53能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期捕獲、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù),從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療、熱療和化學(xué)藥物的敏感性,這些優(yōu)點(diǎn)使p53基因的功能在腫瘤的治療和預(yù)防方面得到越來(lái)越多的關(guān)注。

        隨著對(duì)p53基因的研究,更多治療腫瘤的新思路被提出:下調(diào)突變型p53基因的活性與表達(dá);引入特殊的細(xì)胞因子,抑制腫瘤的惡性表型,進(jìn)而使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)為正常的細(xì)胞;采用點(diǎn)突變,修復(fù)突變基因或使突變基因失活。

        隨著p53基因網(wǎng)絡(luò)的提出,人們將對(duì)P53在各種癌癥中的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究,不是孤立地觀察各個(gè)基因,而是結(jié)合起來(lái)分析。相信該基因的作用將會(huì)得到更好的闡述,同時(shí)會(huì)充分利用P53功能及突變尋找更有效的載體,提高轉(zhuǎn)染率,開發(fā)更多的可有效治療各種癌癥的藥物。

        [1] 閆毓秀,張淑萍,滑靜.p53基因研究進(jìn)展[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(2):74-77.

        [2] Lane D P,Crawford L V.T antigen is bound to a host pro?tein in SV40-transformed cells[J].Nature,197,278(5701):261-263.

        [3] Day A,Verma C S,Lane D P.Modulation of p53 degrada?tion as a therapeutic approach[J].Cancer,2008,98(1):4-8.

        [4] 李莉,祝峙,方國(guó)恩,等.COX-2和p53在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性[J].中華腫瘤防治雜志,2006,139(4):287.

        [5] Murray Zmijewski F,Lane D P,Bourdon J C,et al.p53/p63/p73 isoforms:an orchestra ofisoforms:an orchestra ofiso?forms to harmonise cell differentiation and response to stress[J].Cell Death Differ,2006,13(6):962-972.

        [6] Wirtenberger M,Frank B,Hemminki K,et al.Interaction of Wernerand Bloom syndrome geneswith p53 in familial breast cancer[J].Carcinogenesis,2006,27:1655-1660.

        [7]周曉穎,陳可欣.p53基因多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].腫瘤研究與臨床,2011,23(9):646-648.

        [8] Laptenko O,Prives C.Transcriptional regulation by p53:one protein,many possibilities[J].CellDeath Differ,2006,13(6):951-961.

        [9] Zhu W G,Hileman T,Ke Y,et al.5-aza2-deoxycytidine ac?tivities the p53/p21WAFI/CIPIpathway to inhibit cell proliferation[J].J Biol Chem,2004,279(15):15161-15166.

        [10]Moreira I S,Fernandes P A,Ramos M J.Protein-protein rec?ognition:acomputationalmutagenesisstudyoftheMDM2-P53 complex[J].Theor Chem Account,2008,120(1):533-542.

        [11]Svane I M,Pedersen A E,Nikolaisen K,et al.Aiterations inp53-specific T cells and other1ymphocyte subsets in breastcancerpatientsduringvaccination with p53-peptide loaded dendritic cells and Iow-dose interleukin-2[J].Vaccine,2008.26(36):4716-4724.

        [12]Bao Y P,Wei T F,Lefebvre P A,et al.Detection of protein analytesvia nanoparticle-based bio barcode technology[J].Anal Chem,2006,78(6):2055-2059.

        [13]Faulk W P,Taylor G M.An immunocolloid method for the electron microscope[J].Immunochemistry, 1971,8(11):1081-1083.

        [14]吳幸,崔海寧,明松林,等.P53和Bcl-2家族蛋白在胰腺癌中的表達(dá)[J].世界華人消化雜志,2009,17(4):368-372.

        [15]安莉,王靜,俞森洋.COX-2和p53蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與微血管生成的相關(guān)性研究[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù),2007,14(1):1-4.

        [16]Cioffi M,Vietri M T,Gazzerro P,et al.Serum anti-p53 anti?bodies in lung cancer:comparison with established tumor markers[J].Lung Cancer,2001,33(2-3):163-169.

        [17]周決,曹世龍,陳潔,等.流式細(xì)胞儀同時(shí)檢測(cè)實(shí)體腫瘤P53蛋白和DNA含量[J].中國(guó)癌癥雜志,2000,10(2):101-103.

        [18]Shiota G,Kishimoto Y,Suyama A,et al. Prognostic signifi?cance of serum anti-p53 antibody in patients with hepatocellu?lar carcinoma[J].J Hepatol,1997,27(4):661-668.

        [19]Oda E,Ohki R,Murasawa H,et al.Noxa,a BH3-member of the bc1-2famiIy and candidate mediator of p53-induced apop?tosis[J].Science,2000,288:1053-1058.

        [20]Head S R,Rogers Y H,Parikhk K,et al.Nested genetic bit analysis(N-GBA)for mutation detection in the p53 tumor sup?pressor gene[J].Nucleic Acids Res,1997,25(24):506-5071.

        [21]Faried A,Faried L S,Kato H,et al.Targeting p53 tumor suppressor to induce apoptosis and cell cycle arrest in esopha?geal cancer cells by novel sugar-cholestanols compounds[J].Poster Session,2008,7(10):83-84.

        猜你喜歡
        抗體基因蛋白
        Frog whisperer
        修改基因吉兇未卜
        奧秘(2019年8期)2019-08-28 01:47:05
        豬胎盤蛋白的分離鑒定
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:00
        創(chuàng)新基因讓招行贏在未來(lái)
        商周刊(2017年7期)2017-08-22 03:36:21
        抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
        基因
        自噬蛋白Beclin-1在膽囊癌中的表達(dá)及臨床意義
        SAK -HV 蛋白通過(guò)上調(diào) ABCG5/ABCG8的表達(dá)降低膽固醇的吸收
        C-Met蛋白與HGF蛋白在舌鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義
        乙肝抗體從哪兒來(lái)
        肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:44
        97精品伊人久久大香线蕉| av在线免费高清观看| 欧美激情肉欲高潮视频| 欧美艳星nikki激情办公室| 欧美成人久久久免费播放| 亚洲精品天堂在线观看| 亚洲一区二区三区在线最新| 99久久精品免费看国产一区二区三区| 亚洲精品第一页在线观看 | 日韩性感av一区二区三区| av手机在线观看不卡| 成人网站在线进入爽爽爽| 一本无码人妻在中文字幕免费| 亚洲中久无码永久在线观看软件| 國产AV天堂| 国产精品久久中文字幕亚洲| 91精品国产综合久久久密臀九色 | 特黄三级一区二区三区| 精品亚洲一区二区在线观看| 亚洲人成人无码www| 夜夜躁狠狠躁2021| 亚洲AⅤ无码国精品中文字慕| 无码高潮少妇毛多水多水免费| 国产精品av网站在线| 成人女同av在线观看网站| 毛片a级毛片免费观看| 久久香蕉成人免费大片| 日本免费一区精品推荐| 一区二区在线视频免费蜜桃| 亚洲av片在线观看| 亚洲精品成人专区在线观看| 国产人成在线成免费视频 | 成人毛片无码一区二区三区| 国产精品无需播放器| 日产精品一区二区三区免费| 亚洲视频免费在线观看| 国产草草影院ccyycom| 亚洲欧美国产日韩字幕| 亚洲国产精品午夜一区| av一区二区三区在线| 国产农村乱子伦精品视频|