李 鵬(綜述)，端 青，宋立華(審校)

衣原體是一類專性真核細胞內(nèi)寄生、具有獨特發(fā)育周期、可以在多種真核生物宿主(包括人、動物、原蟲等)中繁殖的細菌。這類菌的共同特征是：(1)革蘭染色陰性；(2)有核糖體和細胞壁；(3)有獨特的發(fā)育周期，有感染能力的始體(EB)首先在胞漿囊泡內(nèi)分化成有繁殖能力的網(wǎng)狀體(RB)，RB以二分裂方式繁殖，在發(fā)育周期的中后期RB重新分化為EB；(4)含有DNA和RNA兩類核酸。衣原體感染宿主廣泛，可以引起人與動物多種疾病，感染人可導致沙眼、肺炎、泌尿系統(tǒng)疾病等，感染動物如家禽、家畜可導致嚴重經(jīng)濟損失[1]。本文綜述了衣原體分類的新進展與衣原體的生物學與分子生物學分類特征，對衣原體分類鑒定、流行病學調(diào)查等具有指導意義。

1 衣原體最新分類體系

衣原體按照細菌分類學，界、門、綱、目、科、屬、種進行具體劃分。最新的第2版《伯杰系統(tǒng)細菌學手冊》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)依據(jù)16S rRNA基因的同源性將衣原體歸為獨立的衣原體門(Chlamydiae)[2]。衣原體門包括一個衣原體綱(Chlamydiia)，一個衣原體目(Chlamydiales)，衣原體目下設(shè)8個科、11個屬。其中與人或動物衣原體病相關(guān)的衣原體主要歸類到衣原體科(Chlamydiaceae)，該科有一個衣原體屬(Chlamydia)，包含12個衣原體種：沙眼衣原體(C.trachomatis)、鼠衣原體(C.muridarum)、豬衣原體(C.suis)、肺炎衣原體(C.pueumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、流產(chǎn)衣原體(C.abortus)、家畜衣原體(C.pecorum)、豚鼠衣原體(C.caviae)、貓衣原體(C.felis)、朱鷺衣原體(C.ibidis)[3]、鳥衣原體(C.avium)和家禽衣原體(C.gallinacea)[4]。其中朱鷺衣原體、鳥衣原體和家禽衣原體是新發(fā)現(xiàn)的衣原體種(詳介見下面)。圖1顯示了衣原體科內(nèi)各代表種與其它科代表菌株的16S rRNA進化地位。

上一次衣原體分類體系的變革發(fā)生在1999年，美國學者Everett等以16/23S rRNA序列相似度為依據(jù)，提出了建立嗜衣原體屬(Chlamydophila)和多個新種如豬衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體和貓嗜衣原體等[5]。在這個舊的分類體系中，新劃出的幾個衣原體新種得到了認可，但關(guān)于嗜衣原體屬的提議遭到了多數(shù)衣原體學家的反對。該屬當時只有一個種水平上的鑒定依據(jù)—rRNA序列同源性大于95%，這個分類依據(jù)遭到了質(zhì)疑，原因概括有：①16S rRNA雖被稱為細菌進化的化石，但分類學家已發(fā)現(xiàn)16S rRNA序列分析不適用于所有細菌種的鑒定；②沒有傳統(tǒng)上易接受的生物學分類標記，成立嗜衣原體屬的必要性不充分；③僅有的rRNA分類依據(jù)在屬分類上已造成了混亂，如鼠衣原體與豚鼠嗜衣原體屬于兩個屬但它們的16S rRNA同源性性卻大于95%[6]。國際衣原體分類委員會于2009年取消了嗜衣原體屬的說法[7-8]。第2版《伯杰細菌學系統(tǒng)手冊》也依據(jù)命名穩(wěn)定、避免混淆的原則只保留了“衣原體屬”的命名。事實上嗜衣原體屬的提議一直沒有得到統(tǒng)一應用，最新的衣原體分類體系在實際應用中具有更鮮明的指導意義[9]。

2 新發(fā)3種衣原體—朱鷺衣原體、鳥衣原體和家禽衣原體

Vorimore等在2013年報道了在法國西部的野生鳥—埃及圣鹮(feral sacred ibis)上分離到一個新衣原體種—朱鷺衣原體(Chlamydiaibidis)[3]；埃及圣鹮的學名為Threskiornisaethiopicus，屬于鹮屬，朱鷺科；Ibidis是ibis(朱鷺)的所有格，我們因此將Chlamydiaibidis翻譯為朱鷺衣原體，有兩個分離株10-1398/6和10-1389/1，其中10-1398/6為模式株。

Fig.1 Total length sequence of 16S rRNA phylogenetic tree of representative strains in Chlamydiales

Konrad等通過分析鴿子、鸚鵡、家禽中的未歸類衣原體分離株，提出命名兩個新種—鳥衣原體(Chlamydiaavium)和家禽衣原體(Chlamydiagallinacea)[4]，二者的模式菌株分別是10DC88，08-1274/3。目前已知的鳥衣原體菌株來源于鴿子和鸚鵡，而家禽衣原體菌株則分離自肉雞、珍珠雞、火雞及其它家禽。

以上3種新發(fā)衣原體均可以從鳥類的泄殖腔和糞便中分離到，在電鏡下有典型的RB與EB，可以用接種雞胚卵黃囊法或細胞法培養(yǎng)，但它們的致病性還不明確。多數(shù)動物衣原體的宿主存在多樣性，它們很有可能會感染其它的鳥類或動物，甚至人。衣原體的種類和宿主范圍都在擴展，生物多樣性在衣原體學科上初步開始展現(xiàn)，可能還有較多的未知衣原體有待發(fā)現(xiàn)，有待于衣原體專業(yè)工作者去研究。

3 衣原體分類鑒定方法

衣原體的分類鑒定依據(jù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)方法(形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特征、抗原結(jié)構(gòu)、血清學方法等)到近年來越來越倚重分子遺傳學方法的發(fā)展過程。1956年我國學者湯飛凡等首次報道了在沙眼患者病料中分離到沙眼病毒，這是衣原體研究史上的一個里程碑進展[10]。在分離到沙眼病原后，1957年衣原體根據(jù)宿主的不同被分為兩個種：感染動物的鸚鵡熱衣原體、與感染人眼部或生殖道系統(tǒng)的沙眼衣原體，詳見《第八版伯杰細菌鑒定手冊》(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Eight Edition)。近60年過去了，如前所述，衣原體的分類系統(tǒng)已發(fā)生了巨大變化。每一個新科、新種的定義都是分析衣原體分類學研究的例子。目前的衣原體的分類鑒定依據(jù)是傳統(tǒng)分類方法與分子遺傳學方法的融合，一個很好的例子就是新發(fā)現(xiàn)的朱鷺衣原體的分類與鑒定。

3.1傳統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析與血清學方法仍是衣原體分類鑒定重要依據(jù) 傳統(tǒng)的衣原體分類鑒定依據(jù)主要有形態(tài)結(jié)構(gòu)、糖原的積累、磺胺嘧啶敏感性、血清學方法等?；谝略w的描述性定義可以看出，在生物表型上目前已知的衣原體均有獨特的發(fā)育周期，也即具有EB與RB兩種結(jié)構(gòu)形式，因此通過電鏡進行形態(tài)學分析是衣原體鑒定的第1步，特別是新發(fā)現(xiàn)衣原體的分類鑒定。電鏡不是微生物分類的常用工具，但可直接提供衣原體的形態(tài)、原核本質(zhì)、細胞壁結(jié)構(gòu)等，是研究或分類衣原體的重要工具。早前，生物學特征如糖原染色特性與磺胺嘧啶敏感性，曾用于沙眼與鸚鵡熱衣原體種的鑒別[2]。表1概括了衣原體屬內(nèi)10個種的基本生物學特征，可以看出隨著衣原體種類的增加，傳統(tǒng)的有限的生物學特征已不能適應衣原體分類的需要。事實上現(xiàn)在已知，由于衣原體不能進行胞外繁殖、不同的衣原體專業(yè)實驗室有自己傳統(tǒng)的研究平臺，個別表型如糖原染色性質(zhì)等在不同的實驗體系上可能存在較大差異。在體外研究模型中，有限的、還可能是不穩(wěn)定的衣原體理化性質(zhì)分類依據(jù)已成為歷史。

血清學方法常用于衣原體的詳細分類，特別是常見衣原體種如沙眼衣原體與鸚鵡熱衣原體的血清學分型。目前沙眼衣原體有15個血清型，分別為A，B，Ba，C-K，L1，L2，L3，其中A-C為眼睛生物型，D-K為生殖生物型，L1-L3為LGV生物型[2]；鸚鵡熱衣原體有9個血清型，分別為A-F，E/B，M56與WC。衣原體的血清型特異性抗原決定簇均位于ompA編碼的主要外膜蛋白(MOMP)，在實際應用中血清分型已被ompA基因分型代替[11]。MOMP是衣原體外膜的主要組成部分，是衣原體的黏附素之一，是重要的衣原體中和保護性抗原。以上眾多的血清型表明MOMP有可能在衣原體的免疫逃避中發(fā)揮作用，這對研制具有泛保護活性的衣原體疫苗具有指導意義[12-13]。雖然ompA基因分型已普遍應用，但在鑒定新的ompA基因型時仍需要使用血清學方法(中和實驗或免疫熒光)進行驗證。值得一提的是，ompA被認為是衣原體發(fā)生變異或重組的活躍基因，但目前臨床上還沒有發(fā)現(xiàn)新的ompA基因型，未來大范圍的ompA流行病學調(diào)查將有助于理解ompA的變異性或保守性及其在衣原體進化中的作用。

Tab.1 Basic biological characteristics of 12 species in Chlamydia

3.2分子遺傳學方法是目前衣原體分類鑒定的常用方法和標準方法 目前衣原體分類鑒定的分子遺傳學依據(jù)主要有16S rRNA序列分析、ompA序列分析(也用于基因分型)、特異性基因分析和級聯(lián)基因序列分析等。①由于16S rRNA基因的高度保守性和種屬差異性，其是目前細菌學分類鑒定的金標準，Everett等提出的在科屬水平上分類衣原體的16S rRNA同源性閾值已被認可。第二版《伯杰系統(tǒng)細菌學手冊》依據(jù)16S rRNA基因全長序列的同源性成立了衣原體門，衣原體門內(nèi)16S rRNA相似性>80%，衣原體目內(nèi)不同科間的16S rRNA相似性為80%～90%，同一科不同屬間的16S rRNA相似性>90%，各屬內(nèi)部的16S rRNA序列相似性>95%，株與株之間16S rRNA序列相似性>99%時認為它們是同一種中的不同株[2]。②除了16S rRNA，ompA序列分析常用于衣原體種的鑒定與基因分型。③特異性基因分析是衣原體分類鑒定的一個方法，可參考Griffiths等在Everett的分類系統(tǒng)基礎(chǔ)上對衣原體蛋白質(zhì)組進行的BLAST分析結(jié)果。作者共篩選出了59個衣原體門特異蛋白、79個衣原體科特異蛋白、衣原體屬和嗜衣原體屬特異蛋白各20個[14]。④級聯(lián)基因序列分析是理解衣原體親緣性和進化關(guān)系的一個補充方法。Richard等將110個衣原體保守基因串聯(lián)后進行種系發(fā)育分析[6]，結(jié)論與16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生樹有所不同，體現(xiàn)了這個方法的價值。在對發(fā)現(xiàn)朱鷺衣原體的文章中，Vorimore等對16S rRNA、ompA、及31個保守基因級聯(lián)后進行了序列比較分析，確認了其為衣原體科的一個新物種。

3.3全基因組分析是分類鑒定新發(fā)現(xiàn)衣原體的必要方法 隨著測序技術(shù)的發(fā)展，微生物基因組學已進入了大數(shù)據(jù)時代，基因組序列現(xiàn)已成為報告新發(fā)現(xiàn)微生物的必需數(shù)據(jù)，如發(fā)現(xiàn)朱鷺衣原體的文章同時發(fā)表了代表株的全基因組序列。將全基因組引入細菌的分類鑒定具有積極的意義。與傳統(tǒng)分類依據(jù)相比，基因組為微生物分類鑒定提供了更加豐富的分類依據(jù)，更能相對準確地體現(xiàn)微生物的自然進化史。分類學家利用了全基因組序列中更多的分類特性來確定種屬相似度，如基因的排列順序、核心基因的分析(基因的存在、缺失或序列比對)、核心基因中單核苷酸的多態(tài)性、種系發(fā)育樹構(gòu)建、同源基因的平均核酸序列一致性(AverageNucleotideIdentity, 簡寫為ANI)等。在全基因組測序使用中，一般認為ANI值>96%則兩株細菌屬于同一個種，這一數(shù)據(jù)的應用在16S rRNA序列相似性>98.7%時顯得尤為重要[15]。

目前使用基因組進行系統(tǒng)分類還有局限性[16]，①微生物主要譜系的全基因測序數(shù)據(jù)還很缺乏；②即使有全基因組數(shù)據(jù)可以利用，但其并不是典型菌株，其可靠性還有待商榷；③由于測序手段和技術(shù)的差異使得已經(jīng)完成的全基因組數(shù)據(jù)存在很大差別，需要對最小測序質(zhì)量提出一個定義，來解決全基因組測序的差異性；④衣原體為專性胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)和純化的技術(shù)要求高，加上全基因組分析需要專業(yè)的生物信息學支持，故目前只有少數(shù)專業(yè)實驗室具備衣原體全基因組分析能力；⑤基因組學雖然極大促進了進化與分類學研究，但應當看到我們對微生物進化的理解還很有限，還需要從基因功能的方向繼續(xù)深入研究。盡管有以上局限性，由于衣原體專性在囊泡內(nèi)繁殖、其接觸外源基因的幾率低、其基因組被認為高度保守，全基因組分析在衣原體分類上的應用有特殊的優(yōu)勢。

4 結(jié) 語

衣原體是一大類與人關(guān)系密切的微生物，其分類體系對教學、科研等均有直接的指導意義。最新衣原體分類體系的最大變化是取消了嗜衣原體屬，3種新發(fā)衣原體使衣原體屬進一步擴展到了12個種。除了3種新發(fā)衣原體，這個分類方法已得到國外衣原體學家的認可，我國也有必要在今后使用這個分類系統(tǒng)。目前衣原體分類鑒定的常用方法主要有16S rRNA、ompA及其它特異性基因序列分析，級聯(lián)基因序列分析；形態(tài)結(jié)構(gòu)和血清學特征是定義、分型衣原體的重要依據(jù)；全基因組測序為分類鑒定新發(fā)現(xiàn)衣原體提供了強有力的工具。無疑，衣原體的分類體系與方法仍在快速發(fā)展中，特別是新發(fā)現(xiàn)衣原體種的快速增加，如2013年8月PLoS ONE雜志報道的重要魚類衣原體病原體CandidatusSyngnamydia venezi[17]。隨著更多新發(fā)現(xiàn)衣原體種的分類鑒定和分類方法的發(fā)展，衣原體分類系統(tǒng)將更臻合理完善。

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