楊 玲，焦 倩，曾文鋌，梁增偉，謝栩碩

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染高流行區(qū)，一般人群乙肝表面抗原(HBsAg)流行率為7.18%[1]。慢性乙型肝炎患者可因多種因素出現(xiàn)肝臟炎癥活動(dòng)，大部分肝炎活動(dòng)預(yù)后良好，但嚴(yán)重的肝炎活動(dòng)可進(jìn)展為肝衰竭；肝衰竭來勢兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，病死率高。目前肝衰竭預(yù)警預(yù)測和確定病情的評(píng)估指標(biāo)尚不完善，存在一定的缺陷。本研究分析慢性乙型肝炎患者中出現(xiàn)肝炎活動(dòng)的病例，探討影響嚴(yán)重肝炎活動(dòng)預(yù)后的因素，篩選出預(yù)測進(jìn)展為肝衰竭的臨床和病毒學(xué)指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)收集南方醫(yī)院及廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院于2008年1月至2009年6月住院治療的嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者。嚴(yán)重肝炎活動(dòng)定義為文獻(xiàn)報(bào)道[3]：慢性乙型病毒性肝炎基礎(chǔ)上，本次發(fā)病時(shí)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT) ≥ 600 U/L，總膽紅素(TB) ≥51.3 μmol/L及40% <凝血酶原時(shí)間活動(dòng)度(PTA)≤50%[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染；肝硬化；肝癌；嚴(yán)重代謝性肝病或自身免疫性肝病者；藥物性肝炎；長期免疫抑制劑治療者，包括器官移植后患者；妊娠。另外排除化療藥物或免疫抑制劑使用導(dǎo)致的肝炎活動(dòng)，排除核苷類似物停藥導(dǎo)致的肝炎活動(dòng)。

嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照2006年我國的《肝衰竭診療指南》[3]：出現(xiàn)以下表現(xiàn)者：①極度乏力，有明顯的消化道癥狀。②黃疸迅速加深，TB ≥正常值上限10倍或每日上升≥17.1 μmol/L。③PTA≤40%并排除其他原因者。

收集患者的臨床指標(biāo)：包括ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、TB、PTA、白蛋白(ALB)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、肌酐(Cr)和HBV DNA定量。收集血清，鑒定BCP(A1762T/G1764A)變異、PC(G1896A)變異及HBV基因型。

1.2HBV BCP和PC變異檢測 擴(kuò)增方法如下：取HBV DNA 2 μL，用引物Is2-2(5′-CATGGAGACCAC CGT GAACGC-3′)和P35(5′-TGATAAGATAGGGGCATTTG-3′)擴(kuò)增HBV PreC/C區(qū)。反應(yīng)總體積為20 μL；擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性1 min；然后94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸50 s，共循環(huán)35圈；最后72 ℃再延伸5 min。取第1輪PCR產(chǎn)物2 μL，用引物P9和P35進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μL；擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性1 min；然后94 ℃變性20 s，55 ℃退火25 s，72 ℃ 延伸40 s，共循環(huán)35圈；最后72 ℃再延伸5 min。取第2輪PCR產(chǎn)物3 μL，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察。序列測定取擴(kuò)增成功且產(chǎn)物帶明顯的樣本以引物Is2-2送測序。對(duì)于擴(kuò)增陰性的標(biāo)本，換用引物P1(5′-TTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3′)和P35進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，用P1和HC24R(5′-CCTGAGTGCTGTATGGTGAGG-3′)進(jìn)行半巢式第2輪擴(kuò)增。測序工作由廣州英駿公司完成，測序儀為ABI 3730。

1.3HBV基因分型鑒定 用PCR限制性片段長度酶切法(PCR-RFLP)按文獻(xiàn)所述進(jìn)行[8]。取抽提的DNA3 μL, 先用1 對(duì)外引物BS1 (5′-CCTG CTGGTGGCTCCAGTTCC-3′)和Pol2 (5′-CGGGCAACGGG GTAAAGGTTC-3′)進(jìn)行第一 輪PCR 擴(kuò)增；再用1 對(duì)內(nèi)引物YS1(5′- GCGGGGTTTTTCTT GTT GA-3′)和YS2 (5′-GGGACTCAAGATGTTGTACA-3′)進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物分別用內(nèi)切酶StyI和BsrSI進(jìn)行酶切。兩種酶切產(chǎn)物同時(shí)在2.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物酶切情況，根據(jù)圖譜分型：如果BsrSI可切的，StyI不可切，為B；如果BsrSI不可切的，StyI可切，為C；均切動(dòng)或均切不動(dòng)取擴(kuò)增產(chǎn)物送測序。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 軟件。運(yùn)用Logistic回歸單因素分析各研究變量與研究結(jié)果的關(guān)系，并計(jì)算優(yōu)勢比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)。單因素分析有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量進(jìn)行二分類Logistic分析，篩選出相關(guān)的危險(xiǎn)因素。P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者的臨床及病毒學(xué)資料 調(diào)查69例嚴(yán)重肝炎活動(dòng)的患者，其中62例患者既往未接受或不規(guī)范短期使用核苷類似物治療，此次使用拉米夫定(LMD)或恩替卡韋(ETV)治療，7例患者既往曾使用LMD耐藥，此次加用阿德福韋酯(ADV)或代丁治療。治療中以內(nèi)科治療為主，均未進(jìn)行肝移植；其中有3例患者進(jìn)行了2～3次血漿替換治療，1例存活，2例死亡；1例患者在病程早期應(yīng)用2天甲強(qiáng)龍沖擊治療。69例患者中，63例男性，6例女性；年齡33歲(20-54) [中位數(shù)(最小值-最大值)]。發(fā)病時(shí)臨床資料為：ALT 343 IU/L (18～2481)，AST 207 IU/L (41～1359)，ALB 33 g/dL (25.2～43.6)，TB 224 μmol/dL (39.2～704.0)，PTA 40.5%(8～138)，Cr74 μmol/dL (49～436)，PLT計(jì)數(shù) 160×1012/L (42～348)，WBC計(jì)數(shù) 6.2×109L-1(2.3～13.4)，HBV DNA定量5.4lg copies/mL (3.00～9.11)。40例(40/69, 58%)患者為HBeAg陰性。基因型以B型和C型多見，其中以基因B型為主(46/65, 70.8%)；有2例患者為基因D型。68例患者鑒定了PC(G1896A)變異，其中PC變異率為54.4%；52例患者鑒定了BCP(A1762T/G1764A)變異，BCP變異率為42.3%；其中9例患者同時(shí)發(fā)生BCP和PC變異。

2.2嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭的預(yù)測因素 通過Logistic回歸單因素和多因素分析與嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展成肝衰竭相關(guān)的指標(biāo)(表1)。單因素分析顯示TB>256 μmol/dL、PTA<40%與嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭相關(guān)。單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)TB及PTA納入多因素分析，通過多因素分析顯示：T >256 μmol/dL (P=0.008)、PTA <40%(P<0.001) 是嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭的危險(xiǎn)因素。而與進(jìn)展為肝衰竭相關(guān)的其他指標(biāo)中，HBeAg陰性的優(yōu)勢指數(shù)OR為4 826.370，P=0.065；PC變異的優(yōu)勢指數(shù)OR=0.033，P=0.090。

表1 嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展成肝衰竭相關(guān)的因素分析

2.3嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者與結(jié)局相關(guān)的因素 在69例嚴(yán)重肝炎活動(dòng)的患者中，有33例(47.8%)患者進(jìn)展為肝衰竭，均未實(shí)施肝移植，有15例(21.7%)患者在住院期間或隨訪3個(gè)月后死亡。分析與預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)見表2。單因素分析顯示與嚴(yán)重肝炎活動(dòng)預(yù)后不良相關(guān)的指標(biāo)包括：TB>256 μmol/dL，PTA<20%。多因素分析顯示PTA <20%(P=0.006)是嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者死亡的危險(xiǎn)因素。嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者中PTA<20%的患者共11例，臨床及病毒學(xué)資料見表3。發(fā)病時(shí)臨床資料為：ALT 601 IU/l (50～1 482)，TB 452 μmol/dL (122.7～591.9)，ALB 30.9 g/dL (25.4～37.1)?；駼型為主(8/11)，6例(6/11)患者為HBeAg陰性。6例(6/11)患者發(fā)生PC(G1896A)變異，6例(6/9)發(fā)生BCP變異，其中3例患者同時(shí)發(fā)生BCP和PC變異。9例(9/11)患者死亡。

3 討 論

每年有超過30%的慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)肝炎活動(dòng)[4]，其中部分嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭；評(píng)估嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展成肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于早期治療和干預(yù)非常重要。本研究通過調(diào)查由嚴(yán)重肝炎活動(dòng)快速進(jìn)展為肝衰竭的臨床和病毒學(xué)指標(biāo)，篩選預(yù)測進(jìn)展為肝衰竭的指標(biāo)。研究中所收集的嚴(yán)重肝炎活動(dòng)的病例，根據(jù)臨床指標(biāo)顯示TB中位數(shù)224 μmol/dL、PTA中位數(shù)40.5%，提示患者的病情均較重，因此進(jìn)展成肝衰竭的風(fēng)險(xiǎn)高，這與以往的研究中選擇慢性乙型肝炎患者作為對(duì)照不同，所以能更好的提供進(jìn)展成肝衰竭的預(yù)測因素。

在嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭的指標(biāo)中，多因素分析顯示TB>256 μmol/dL、PTA<40%是嚴(yán)重肝炎活動(dòng)預(yù)后不良的因素，與進(jìn)展為肝衰竭相關(guān)。日本Yoshiba[5]篩選出的早期診斷肝衰竭的判別公式中，同樣也顯示TB的水平與肝衰竭的發(fā)生率呈正相關(guān)。本研究進(jìn)一步篩選與嚴(yán)重肝炎活動(dòng)預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)，顯示凝血功能的進(jìn)一步惡化(PTA<20%)與患者的死亡相關(guān)。而作為評(píng)價(jià)終末期肝病存活率的MELD評(píng)分中[6-7]也包含反應(yīng)凝血功能的指標(biāo)：國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)。根據(jù)2008年亞太肝病學(xué)會(huì)慢加急性肝功能衰竭專家組意見將血清總膽紅素(TB≥85 μmol/dL)及凝血障礙(PTA<40%)作為診斷肝衰竭的必要條件[8]；故血清TB及PTA可作為臨床上判斷嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者病情及預(yù)后的重要指標(biāo)。

表2 嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者與預(yù)后相關(guān)的因素分析

表3 嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者中PTA<20%的患者資料

在嚴(yán)重肝炎活動(dòng)發(fā)展為肝衰竭的其他預(yù)測指標(biāo)中，HBeAg陰性(OR 4826.370,P=0.065)、PC變異(OR 0.033,P=0.090)表現(xiàn)與病情的惡化有一定相關(guān)性。在所調(diào)查的嚴(yán)重肝炎活動(dòng)患者HBeAg陰性率高達(dá)58%；且發(fā)生PC變異的患者也明顯增多，PC變異率(37/68, 54.4%)與同期所收集的44例慢性乙型病毒性肝炎患者(8/44,18.2%)[9]比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。且基因B型的比率也較同期收集的慢性乙型肝炎患者增高[70.8%(46/65) vs. 50%(22/44);P=0.002]，而基因B型更易發(fā)生PC變異[11]。PC發(fā)生變異后，在前C末端產(chǎn)生終止密碼子，使HBeAg不能合成，導(dǎo)致HBeAg陰性。HBeAg作為耐受原，通過使Th1輔助細(xì)胞耗竭來抑制Th1細(xì)胞發(fā)動(dòng)CTL攻擊感染肝細(xì)胞的能力；而當(dāng)HBeAg分泌的減少后，機(jī)體免疫耐受的狀態(tài)被打破，使受感染的肝細(xì)胞更容易受到攻擊；從而出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，臨床上表現(xiàn)為肝炎發(fā)作[10]，嚴(yán)重者進(jìn)展成肝衰竭。

BCP變異未顯示與預(yù)后高的相關(guān)性(OR 0.986,P=0.989)，考慮在本研究中所調(diào)查的人群中基因C型的比例少19.2%(19/65)，而BCP變異更易發(fā)生在基因C型的患者中所致[11]。但調(diào)查顯示BCP變異率也高達(dá)42.3%，且在11例PTA<20%的患者共6例(6/9)發(fā)生BCP變異，所以在以后的研究中，通過擴(kuò)大樣本量，可以能更好反映BCP變異與預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，由此顯示總膽紅素升高及凝血功能障礙在預(yù)測HBV相關(guān)的嚴(yán)重肝炎活動(dòng)進(jìn)展為肝衰竭中有顯著的意義。而HBeAg陰性引起免疫耐受被打破，機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生改變，可能作為導(dǎo)致肝炎發(fā)作的原因之一。

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