焦安心，許大文，趙洪武，程 謙，鄭 浩，馬建華，魏建忠，孫 裴，李 郁

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是世界范圍內(nèi)引致豬鏈球菌病最主要的病原，根據(jù)莢膜多糖可將S.suis分為35個(gè)血清型，即1型～34型和1/2型，其中2型(Streptococcussuisserotype 2,S.suis2)對(duì)豬的致病性最強(qiáng)，在世界范圍流行最廣，而且是重要的人獸共患病病原菌之一[1]。

S.suis2的致病性與其攜帶的毒力因子密切相關(guān)，目前公認(rèn)的主要毒力因子有莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular protein factor，EPF)和溶血素(Suilysin，SLY)等[2]。S.suis2毒力基因的分布具有地域性差異，不同地區(qū)S.suis2分離株可能含有不同的毒力因子，這是S.suis2不同分離株毒力不同的重要原因[3]。SLY在S.suis2侵入和裂解細(xì)胞的過(guò)程以及導(dǎo)致腦膜炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用，溶血類型及溶血價(jià)常作為初步判斷其致病力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一[4]。目前，由于抗生素不合理應(yīng)用，S.suis2耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，不同地區(qū)在抗生素的選擇壓力下，S.suis2的耐藥表型出現(xiàn)了地域性差異。

本研究通過(guò)對(duì)來(lái)自獸醫(yī)臨床上19株S.suis2安徽分離株的毒力基因、溶血性及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在為進(jìn)一步研究S.suis2 安徽分離株的致病性奠定基礎(chǔ)，為有效防控豬鏈球菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1受試菌株 19株S.suis2安徽分離株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病研究室分離、鑒定與保存，主要來(lái)自合肥、阜陽(yáng)、亳州、安慶、宿州和蚌埠等地區(qū)。

1.2質(zhì)控菌株 肺炎鏈球菌ATCC49619 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3主要試劑 胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、水解酪蛋白瓊脂(M-H)購(gòu)自紹興天恒生物科技有限公司；2×TaqPCRMasterMix，DNA Marker D2000、DNA Marker I均購(gòu)自北京天根生化有限公司；25種藥敏紙片：氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、新霉素(NEO)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、丁胺卡那霉素(AN)、紅霉素(E)、阿奇霉素(AZZ)、吉他霉素(KIT)、四環(huán)素(TET)、強(qiáng)力霉素(DOX)、恩 諾 沙 星 (ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)、克林霉素(CM)、潔霉素(LIN)、桿菌肽(BAC)、復(fù)方新諾明(SXT)、甲氧芐啶(TMP)、磺胺異惡唑 (SIZ)、氟苯尼考(FLO)、利福平(RA)均購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4毒力基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[5-6]分別針對(duì)cps2J、mrp、epf、sly合成引物(見(jiàn)表1)，特異性引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1 用于擴(kuò)增四種毒力因子的PCR引物

采用裂解法提取細(xì)菌DNA：挑取單菌落接種到含有5%血清的TSB中，培養(yǎng)24 h，取1 mL菌液加入1.5 mL離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μL滅菌ddH2O混勻，置沸水中煮沸10 min，冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，即為DNA模板。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：總體積25 μL ，其中2×TaqPCRMasterMix12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上下游引物各1 μL，模板5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性45 s，cps2J、mrp、epf、sly退火溫度及時(shí)間分別為56 ℃ 50 s、55 ℃ 1 min、60 ℃ 55 s、58 ℃ 1 min，72 ℃ 延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5溶血性檢測(cè)

1.5.1PA法檢測(cè)溶血類型 將19株S.suis2安徽分離株接種于含5%兔血的TSA平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落周圍溶血狀態(tài)。單菌落周圍有透明溶血環(huán)的菌株判定為β溶血；單菌落周圍有草綠色溶血環(huán)的菌株判定為α溶血；不發(fā)生溶血的菌株為γ溶血。

1.5.2micro-ELISA法檢測(cè)溶血價(jià) 參考文獻(xiàn)[4,7]測(cè)定菌株溶血價(jià)，將各菌株接種于含5%血清的TSB，37 ℃靜止培養(yǎng)24 h制成種子液，取種子液按1%比例接種于含5%血清的TSB，37 ℃靜止培養(yǎng)，接種后8 h、12 h、16 h、20 h和24 h取培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min，取上清，10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)生理鹽水倍比稀釋，將不同倍數(shù)稀釋的上清液和等量的1%兔紅細(xì)胞加入96孔板中，振蕩混勻，37 ℃作用2 h，4 ℃過(guò)夜沉淀，測(cè)OD540。溶解50%紅細(xì)胞的上清液的稀釋倍數(shù)即為溶血價(jià)，以5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中測(cè)定的最高溶血價(jià)作為該菌株的溶血價(jià)。

1.6藥物敏感性檢測(cè) 以肺炎鏈球菌ATCC49619為質(zhì)控菌株，采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法及判定標(biāo)準(zhǔn)[8]。

2 結(jié) 果

2.1毒力基因檢測(cè) 19株S.suis2安徽分離株cps2J、mrp、epf和sly基因的檢出率分別為100%、68.4%、68.4%、89.5%，共分為7個(gè)基因型：cps2J+/mrp+/epf+/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly-、cps2J+/mrp-/epf+/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly-，其中cps2J+/mrp+/epf+/sly+所占比例達(dá)57.9%，為優(yōu)勢(shì)基因型(見(jiàn)表2)。

表2 19株S. suis 2安徽分離株毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.2溶血性檢測(cè) 在19株S.suis2安徽分離株中，13株呈α溶血，溶血價(jià)為1∶4～1∶32；6株呈β溶血，溶血價(jià)為1∶32～1∶128。其中CH1溶血價(jià)為1∶64(β溶血)，SZ2溶血價(jià)為1∶32(α溶血)，未檢出sly基因。各菌株溶血類型、溶血價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 19株S. suis 2安徽分離株的溶血性

2.3藥物敏感性檢測(cè) 19株S.suis2安徽分離株對(duì)利福平、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢唑啉的敏感率較高，分別達(dá)到89.5%、89.5%、78.9%、78.9%，對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、桿菌肽和磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為84.2%、84.2%、84.2%、78.9%；分離菌株普遍對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥或中介(見(jiàn)表4)。19株S.suis2安徽分離株均耐3種以上抗生素，且多重耐藥譜為強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、桿菌肽和磺胺異惡唑，構(gòu)成比為63.2%(見(jiàn)表5)。

3 討 論

目前雖然對(duì)S.suis2致病機(jī)制并不十分清楚，但普遍認(rèn)為其致病性強(qiáng)弱與其毒力基因有關(guān)。cps2J、mrp、epf、sly是S.suis2重要的毒力基因，常作為檢測(cè)的靶基因，然而在不同的S.suis2分離株中，其分布特征存在著地區(qū)性差異。2009年，Verena Blume等[9]檢測(cè)101株源自腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎或肺炎豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為33.7%；同年，Wei等[10]針對(duì)我國(guó)16個(gè)省份，檢測(cè)176株源自腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎或心內(nèi)膜炎豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為54%。本研究中，來(lái)自臨診患病豬的19株S.suis2安徽分離株cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為57.9%，表明安徽地區(qū)豬群中S.suis2的毒力基因型與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道基本一致，而與國(guó)外的報(bào)道存在一定差異。此外，不同健康狀況豬體上的S.suis2分離株中，cps2J、mrp、epf、sly的分布特征也存在差異。2000年，F(xiàn)lorence等[2]同時(shí)對(duì)分離自患病豬和健康豬體的S.suis2進(jìn)行檢測(cè)，54株源自患病豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株占35.2%，9株源自健康豬的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株僅占30%；2013年，紀(jì)少博等[11]檢測(cè)194株源自我國(guó)不同地區(qū)健康豬上的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株為33.5%。從而顯示cps2J、mrp、epf、sly4種毒力基因與S.suis2的致病力強(qiáng)弱相關(guān)。

根據(jù)鏈球菌在血瓊脂平板上的溶血現(xiàn)象分為α、β和γ共3類，α-溶血性鏈球菌多為條件致病菌，β-溶血性鏈球菌致病力強(qiáng)，而γ-鏈球菌無(wú)致病性，故溶血性在鑒定鏈球菌的致病性方面有一定的意義。本研究中，19株S.suis2安徽分離株在兔血平板上呈現(xiàn)α和β兩種溶血類型，表明不同S.suis2安徽分離株對(duì)兔紅細(xì)胞溶血能力的差異性及其致病力的不同。鏈球菌溶血性的形成與其產(chǎn)生的SLY相關(guān)，SLY的產(chǎn)生量可以用溶血價(jià)來(lái)衡量。本研究中19株S.suis2，β溶血菌株的溶血價(jià)(1∶32～1∶128)高于α溶血菌株(1∶4～1∶32)，表明β溶血菌株能產(chǎn)生較多SLY，其毒力可能強(qiáng)于α溶血菌株，因?yàn)闆Q定S.suis2毒力大小的因子是多方面的。SLY由sly基因編碼，sly基因全長(zhǎng)1 494 bp，其5′端可發(fā)生變化，從而使sly基因喪失完整性，但這種不完整性卻沒(méi)有改變其溶血特性，甚至不影響其毒力大小[12]。本研究中，19株S.suis2安徽分離株均具有溶血活性，但其中1株β溶血和1株α溶血菌株未檢出sly基因，表明這兩株S.suis2安徽分離株的sly基因發(fā)生了改變。

抗生素療法是目前治療豬鏈球菌病的重要手段，由于臨床上濫用、亂用抗生素現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，給該病的防治帶來(lái)一定困難。本研究中，19 株S.suis2安徽分離株均為多重耐藥，其中對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、桿菌肽和磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為84.2%、84.2%、84.2%、78.9%，且對(duì)該4種抗生素的多重耐藥率達(dá)63.2%，對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥率也較高(50%以上)，且中敏率高達(dá)42.1%，顯示出向產(chǎn)生耐藥性發(fā)展的趨勢(shì)，應(yīng)得到足夠的重視。2005年，Vela等[13]報(bào)道，22株S.suis2法國(guó)分離株對(duì)四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、林克酰胺類多重耐藥率達(dá)68.2%。2010年，徐引弟等[14]對(duì)35株S.suis2河南分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、氯霉素的耐藥情況嚴(yán)重。表明在抗生素選擇的壓力下，不同地區(qū)S.suis2分離株的耐藥特性及多重耐藥性譜存在一定的差異，因此，適時(shí)監(jiān)測(cè)S.suis2的耐藥性及其變化趨勢(shì)，藥敏試驗(yàn)篩選藥物，合理、科學(xué)、規(guī)范用藥，有利于減少和控制耐藥菌株的產(chǎn)生，對(duì)有效防控S.suis2病具有十分重要的意義。

表4 19株S. suis 2安徽分離株的藥物敏感程度分布

表5 19株S. suis 2安徽分離株多重耐藥譜的分布

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