林澤文，周小麗*，俞立英，吳興文，徐 蒙，劉木清

(1.復旦大學光源與照明工程系，上海 200433；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040)

1 引言

光動力療法(Photodynamic Therapy, PDT)是指通過特定波長光的照射，使組織吸收的光敏劑(photosensitizer, PS)發(fā)生光化學反應，在有氧環(huán)境下，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周圍的氧分子，生成活性氧(reactive oxygen species, ROS)與相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應，產生很強的細胞毒性作用，進而導致細胞受損乃至死亡[1]。近年來，PDT作為一種輔助治療方法被廣泛地應用于口腔疾病的治療中，包括牙體硬組織疾病、牙髓疾病、牙周炎癥[2], [3]等。

在PDT中通常采用激光光源，然而目前開發(fā)的所有激光器，由于制作原理和實用價值的原因，限制了其在生物醫(yī)學方面的應用[4]。LED具有高效節(jié)能、壽命長、易維護、結構簡單、電源小巧、價格低廉等特點，使其在家庭便攜PDT的推廣上，有著傳統(tǒng)激光器所無法比擬的優(yōu)勢。LED和激光器的最大的區(qū)別在于光的單色性和相干性。由于PDT治療中所用的光敏劑具有一個較寬的吸收帶，通常為10～20nm，甚至更寬，而目前生產的LED的半波帶寬可以達到±10nm，所以單色性對于治療效果無顯著影響[5]。有相關研究表明光的相干性對光治療產生影響并沒有理論和實際依據(jù)[6]。 本文通過實驗研究LED光源對牙周炎進行光動力治療的可行性，還進一步探究了不同光照參數(shù)組合下的最優(yōu)殺菌治療方案，為家庭便攜式PDT治療儀器的設計提供了理論基礎。

2 實驗裝置

新型光敏劑的強烈吸收帶一般在650～850nm之間[1]，本文中選用660nm波長紅光LED作為照射光源，采用亞甲基藍(methylene blue, MB)作為光敏劑對普雷沃牙周細菌進行體外殺菌實驗。該光敏劑對峰值波長為660nm的紅光有著強烈的吸收，并釋放出大量單態(tài)氧，產生細胞毒素，殺死細菌。本文采用6顆大功率(1W)紅光LED作為陣列對12孔細胞培養(yǎng)板進行照射，保證在照射面形成0～100mW/cm2的輻射照度。每顆LED配以光學透鏡進行聚光，驅動采用可進行PWM調光的恒流驅動模式。圖1為采用光譜分析儀測得的LED陣列的光譜。在全功率輸出時，采用光量子流密度計測得被照射面上的平均輻照度為100 mW/cm2。

圖1 實驗用LED的光譜功率分布圖Fig.1 The spectrum of experimental LEDs

由圖1可以看出LED的峰值波長為657nm，光譜半寬度為20nm，能量主要都集中在MB的強烈吸收帶上。雖然在單色性上LED陣列無法與激光相提并論，但如前文所述，PDT中使用的光敏劑吸收帶帶寬通常為10～20nm，甚至更寬，因此，實驗采用的LED陣列完全能夠滿足治療的要求。

3 實驗研究

3.1 前期準備

3.1.1 細菌液體培養(yǎng)

復蘇從患者牙周膿腫中分離的耐藥野生株，并將其密涂在厭氧基礎培養(yǎng)基血平板(OXID、5%脫纖維羊血)上。將平板放置于35～37℃厭氧環(huán)境中(N280%，H210%，CO210%)孵育2天，得到成熟菌落。取一定量的成熟菌落于液體培養(yǎng)基中，在35～37℃厭氧環(huán)境中(N280%，H210%，CO210%)孵育36小時，得到第二代細菌。

3.1.2 細菌菌液濃度選擇

取經過36小時孵育的菌液，用培養(yǎng)液進行稀釋。取稀釋后的樣本在分光光度計OD600下比濁,測出相應的OD(OD, optical density)值，再比對之前已經做過的OD值與CFU值曲線，即可大致推斷出菌液濃度的數(shù)量級。本文取OD值為0.65～0.75的菌液(此時菌液濃度大致為107CFU/mL)。

3.1.3 紫外殺菌

將LED陣列、驅動、12孔細胞培養(yǎng)板、移液槍等實驗要用到的各項器材置于超凈臺上，進行8分鐘的紫外殺菌。

3.2 光照實驗

3.2.1 實驗分組

12孔細胞培養(yǎng)板編號如圖2所示，其中有顏色標記的6個孔位將用于實驗。記有光照條件為L+，無光照為L-；有光敏劑條件為M+，無光敏劑為M-，則6個孔位的實驗條件如表1所示。

圖2 12孔細胞培養(yǎng)板編號圖Fig.2 Maps of the 12-well cell culture plate

表1 細胞培養(yǎng)板各孔位的實驗條件Table 1 The experimental conditions for each well

3.2.2 實驗參數(shù)

取浮游菌液濃度為107CFU/mL，MB濃度為0.05μmol/mL。光照密度與光照時間的取值如表2所示。

表2 各組實驗的光照密度與光照時間參數(shù)Table 2 Experimental parameters for each group

3.2.3 實驗步驟

① 先在A1、A2、D2孔位加入5μLMB溶液，再加入500μL浮游菌液，孵育2分鐘；

② 在B1、B2、D3中加入對照菌液各500μL；

③ 將LED陣列扣在細胞培養(yǎng)板上，關閉超凈臺工作燈，打開LED電源，按照3.2.2節(jié)設定的實驗參數(shù)對菌液進行照射，如圖3所示；

④ 照射結束后，關閉LED，取出培養(yǎng)板中浮游菌液用于后期處理。

圖3 用LED陣列照射浮游菌液Fig.3 Using the LED array to irradiate the bacteria suspension

3.3 后期處理

3.3.1 菌液稀釋

對A1、A2、B1、B2、D2、D3中的菌液以及細菌原液(共7個樣本)分別進行若干次的10倍次稀釋，以便進行平板菌落計數(shù)。為使計數(shù)值落在置信區(qū)間上，對每一個樣本取6種不同濃度的菌液進行接種，同時考慮到預期的處理效果，每一個樣本的稀釋倍數(shù)如表3所示。

表3 各樣本稀釋倍數(shù)Table 3 Dilution rate of each samples

3.3.2 平板菌落計數(shù)

將稀釋好的菌液接種在厭氧基礎培養(yǎng)基血平板上，每個平板對應一個樣本。平板劃分為6個相同大小的區(qū)域，每個區(qū)域接種一種濃度的菌液。將完成接種的平板放置于35～37℃厭氧環(huán)境中孵育，2天后取出平板進行菌落計數(shù)。將統(tǒng)計出的菌落數(shù)，根據(jù)稀釋的倍數(shù)和取樣接種量換算出每個菌液樣本的CFU值，從而得出樣本的殺菌率，以判斷PDT治療是否有效。

4 實驗數(shù)據(jù)及分析

4.1 實驗數(shù)據(jù)

為準確測量處理后的各樣本菌液濃度，對于每一個實驗樣本，本文選擇了孵育后菌落數(shù)量落在置信區(qū)間的接種樣本，并根據(jù)其稀釋倍數(shù)，換算出原樣本的菌液濃度。表4記錄了每一組實驗的原菌液濃度以及經過處理并孵育的實驗樣本菌液濃度。

表4 原菌液及經過處理后的各實驗組的浮游菌液濃度Table 4 The concentration of the original and the experimental bacteria suspension

4.2 數(shù)據(jù)處理及分析

4.2.1 PDT治療可行性分析

根據(jù)表4，以原菌液濃度為分母，實驗樣本菌液濃度為分子，可以計算出每個樣本經過處理后的牙周致病菌存活率。圖4(a)、(b)、(c)分別表示當光照密度為10、20、40mW/cm2時，在不同的照射時間下，各實驗樣本的致病菌存活率。從圖中可以看出，雖然光照的參數(shù)有所不同，但是在每一個單獨的實驗組中，添加了光敏劑并接受光照的實驗樣本的細菌存活率都要低于其他的實驗樣本。

圖4 各實驗組在不同光照密度下的牙周致病菌存活率Fig.4 The survival rate of bacteria under various irradiation

考慮到孵育環(huán)境以及孵育時間對菌液濃度的影響后，改用雙陰性對照樣本(L-M-)的菌液濃度作為分母，以其他樣本菌液濃度作為分子，求得的牙周致病菌存活率。圖5(a)、(b)及(c)所示的是光照密度分別為10、20、40mW/cm2時，在不同的照射時間下，考慮了時間因素以后的各實驗樣本的牙周致病菌存活率。從圖中可以更明顯地看出，添加了光敏劑并進行光照的實驗樣本組的細菌存活率遠低于其他樣本組。而單獨進行光照或添加光敏劑的實驗樣本，其細菌存活率隨光照密度及光照時間的變化則顯示出較大的離散性。由此可見，使用LED為光源的PDT對于牙周炎的治療的確有效，使用光敏劑的同時對細菌進行光照能夠產生比單獨使用光敏劑或僅僅接受光照更好的殺菌效果。

圖5 考慮了時間因素后各實驗組在不同光照度下的牙周致病菌存活率Fig.5 The survival rate of bacteria under various irradiation when time was considered

4.2.2 PDT治療的最佳光照參數(shù)

圖6所示的是同時添加了光敏劑并進行光照的實驗樣本，在不同光照參數(shù)組合下的細菌存活率。從圖中可以看出，當光照密度較低時(10～20mW/cm2)，致病菌的存活率主要取決與光照時間——隨著光照時間的增加，細菌存活率顯著降低；當光照時間超過16min后，細菌存活率趨于穩(wěn)定，并保持在一個很低的水準(3%以下)。當光照密度較高時(40mW/cm2),細菌存活率隨光照時間增加而下降的幅度大大增加，在照射4min后，致病菌的存活率就低至3%以下；同樣的，在照射16min后，細菌存活率趨于穩(wěn)定，并且保持在一個更低的水準(0.1%以下)。由于在實際治療的過程中，對病人患處進行長時間的照射是十分不便的，且低光照密度照射治療過后仍會保持有3%左右的細菌存活率。因此，本文認為，在實驗的18組不同光照參數(shù)中，以40mW/cm2的光照密度對患處進行8min的照射是比較適宜的治療方案。

圖6 不同光照參數(shù)下的牙周致病菌存活率Fig.6 The survival rate of the bacteria with different irradiation parameters

5 結論

本文通過實驗驗證了LED用于牙周治療的可行性，實驗的數(shù)據(jù)表明，同時使用光敏劑并接受光照的實驗組，較其他的對照組，浮游菌液中的牙周致病菌存活率大大降低，即該實驗組的殺菌效果遠好于其他組。同時，從實驗數(shù)據(jù)中還可以看出，光照時間越長，PDT治療的殺菌率也就越高；當光照密度較高時，殺菌率隨光照時間增加而上升的幅度大大增加。在實驗的18組不同光照參數(shù)中， 40mW/cm2的光照密度配合8min的照射時間是比較適宜的治療方案。本文的研究僅針對以LED為光源的PDT治療對體外牙周致病菌的存活率的影響，至于PDT在臨床上的治療效果是否與體外實驗相一致則有待將來進一步的研究。

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