陶然常玉梅梁利群唐然竇新杰，3王楠，3李明云

（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

Tgf2轉(zhuǎn)座子多克隆位點(diǎn)的克隆與表達(dá)

陶然1，2常玉梅2梁利群2唐然2竇新杰2，3王楠2，3李明云1

（1. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211；2. 淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

以金魚(yú)pTgf2-EF1α-EGFP轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)，構(gòu)建含有多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning sites，MCS）序列以及外源目的基因肌醇-3-磷酸合成酶（Myo-inositol-3-phosphate synthase，MIPS）的重組表達(dá)載體并注射到斑馬魚(yú)1-2期受精卵，檢測(cè)重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MCS-EGFP和pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP在斑馬魚(yú)中綠色熒光蛋白基因（EGFP）的表達(dá)情況以及外源基因MIPS在斑馬魚(yú)體內(nèi)的整合情況。熒光觀察結(jié)果顯示，兩個(gè)重組載體均不影響EGFP的表達(dá)，只是表達(dá)強(qiáng)度存在一定差異，表明對(duì)Tgf2轉(zhuǎn)座子的改造是有效的。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，靶基因MIPS的編碼區(qū)能夠完整地整合到斑馬魚(yú)基因組中，整合效率達(dá)31.4%。重組表達(dá)載體的成功構(gòu)建顯示金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子可以介導(dǎo)外源基因在斑馬魚(yú)中的表達(dá)，為以后Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚(yú)類(lèi)基因功能研究方面奠定了基礎(chǔ)。

金魚(yú) Tgf2轉(zhuǎn)座子 MCS序列 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)

DNA轉(zhuǎn)座子的實(shí)質(zhì)是一段能改變宿主基因組插入位點(diǎn)的DNA序列［1，2］，通常存在于矮牽牛（Petunia hyhridaVilm）、飛燕草（Delphinium grandiflorumL.）、金魚(yú)草（C.demersum）、甜豌豆（Lathyrus odoratusL.）等植物以及一些低等非脊椎動(dòng)物中［3，4］。由于轉(zhuǎn)座子存在種屬特異性，一直以來(lái)轉(zhuǎn)座子在脊椎動(dòng)物中的應(yīng)用仍是空白。直到1996年，日本學(xué)者Koga等［5］首次在白化變異青鳉（Oryzias latipes）中發(fā)現(xiàn)了具有自主轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子——Tol2轉(zhuǎn)座子。Tol2轉(zhuǎn)座子與果蠅（Drosophila melanogaster）Hobo、金魚(yú)草（Antirrhinum majus）Tam3和玉米（Zea maysL.）Ac等均屬于hAT轉(zhuǎn)座子家族［6］。

Tol2轉(zhuǎn)座子作為高效的基因轉(zhuǎn)移工具，在一些脊椎動(dòng)物如斑馬魚(yú)（Danio rerio）、非洲爪蟬（Xenopus laevis）和雞中的轉(zhuǎn)座效率較高［7-9］，而在青鳉中的轉(zhuǎn)座效率還是很低［10］。因此，對(duì)于在不同脊椎動(dòng)物中都能高效表達(dá)的轉(zhuǎn)座子還在不斷探索發(fā)現(xiàn)中。

2010年，鄒曙明［10］等在不同品系金魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了具有自主轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子——Tgf2轉(zhuǎn)座子，此轉(zhuǎn)座子也屬于hAT轉(zhuǎn)座子家族，這是目前發(fā)現(xiàn)的第2個(gè)自主轉(zhuǎn)座的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子。Tgf2轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)4 720 bp，包含4個(gè)完整的開(kāi)放性閱讀框（ORFs）。其與Tol2轉(zhuǎn)座子相似度高達(dá)97%，具有轉(zhuǎn)座必須的末端倒位重復(fù)序列（Terminal inverted repeats，TIRs）、亞末端重復(fù)序列（Subterminal repeats，SRs）和中間倒位重復(fù)序列（Internal inverted repeats，IRs）［11，12］。研究證實(shí)，Tgf2轉(zhuǎn)座子具有高效內(nèi)源性轉(zhuǎn)座活性［13］。金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)此類(lèi)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率、各組成元件的功能研究具有指導(dǎo)性意義和較高價(jià)值，并且構(gòu)建高效、通用的Tgf2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)更會(huì)促進(jìn)魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因和基因捕獲方面的發(fā)展［12，14］。

多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning sites，MCS）是包含多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的長(zhǎng)度為幾十個(gè)堿基的DNA序列，也稱(chēng)為多位點(diǎn)接頭，是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列。然而，由于基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，在將外源基因插入含有MCS的載體中時(shí)，MCS序列包含的酶切位點(diǎn)的種類(lèi)有時(shí)難以滿(mǎn)足特定研究需求，導(dǎo)致特定基因功能分析無(wú)法順利進(jìn)行，形成分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的瓶頸。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單有效的MCS序列的人工設(shè)計(jì)與合成方法，以此滿(mǎn)足不同科研工作的需求。MIPS催化底物葡萄糖-6-磷酸（G6P）轉(zhuǎn)化成磷酸肌醇（IP），是肌醇合成的限速酶MIPS基因［15］。MIPS基因被認(rèn)為是調(diào)節(jié)大腦肌醇水平的潛在藥靶［16］，并且在保護(hù)植物免受外部逆境傷害過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與逆境脅迫處理下的抗性有關(guān)，其表達(dá)受到干旱、鹽脅迫和低溫的誘導(dǎo)［17］。本研究根據(jù)Tgf2載體原始系統(tǒng)，人工設(shè)計(jì)并合成一段符合特定需求的MCS序列，將其克隆至Tgf2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)驗(yàn)證其有效性，以此解決大多數(shù)外源目的基因編碼序列無(wú)法插入到一些商業(yè)化載體中進(jìn)行基因功能驗(yàn)證的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚(yú)與載體來(lái)源 斑馬魚(yú)為AB品系；PMD-18T/MIPS質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室自制pTgf2-EF-1α-EGFP質(zhì)粒由上海海洋大學(xué)鄒曙明老師惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、Nacl 10 g/L，pH7.0），固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉（Agar）15 g/L。

1.1.3 酶與試劑 限制性?xún)?nèi)切酶（ACSI、Xmal I）購(gòu)自NEB，限制性?xún)?nèi)切酶（Hind III、SalI）、大腸桿菌DH5α、pMD18-T載體、Taq聚合酶、2000 DNA Marker、T4 DNA 連接酶、凝膠回收試劑盒均購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）工程公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒TIANGEN公司，其他試劑都是國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。引物合成及測(cè)序由北京英俊生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MCS序列設(shè)計(jì)與合成 利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)多克隆位點(diǎn)序列，從酶切位點(diǎn)表中選擇表達(dá)載體Tgf2及目標(biāo)靶基因中都不存在的11個(gè)酶切位點(diǎn)，分別為Hind III、StuI、BclI、BspE I、PmeI、AscI、SmaI/XmaI、PacI、HaeIII、ScaI、SalI；將設(shè)計(jì)好的MCS序列的兩兩酶切位點(diǎn)之間以ATAT堿基結(jié)構(gòu)串聯(lián)，在串聯(lián)后的堿基序列兩端各添加與表達(dá)載體克隆區(qū)相同的兩個(gè)酶切位點(diǎn)Hind III和SalI；再將上述序列兩末端隨機(jī)添加GGAACC堿基（圖1），然后送至測(cè)序公司合成，由此完成了MCS序列的人工設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)MCS兩端序列，設(shè)計(jì)正向引物P1（5'-CCCAAGCTTATGCATGCATATTG-3'）與反向引物P2（5'-GGTTCCACGCGTCGACATATAGTAC-3'），用于長(zhǎng)度為121 bp MCS寡核苷酸鏈的PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PMD-18T/MCS質(zhì)粒的構(gòu)建 將合成的MCS寡核苷酸鏈利用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）：MCS模板1 μL，引物P1、P2各1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min；反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收MCS條帶，回收條帶與pMD18-T載體連接，16℃水浴連接30 min，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。選擇經(jīng)藍(lán)白斑篩選后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌斑PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（25 μL）Master Mix 12.5 μL，通用引物AVM和M13-47各1 μL，H2O 10.5 μL，PCR擴(kuò)增條件同上；反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，然后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MCS-EGFP（多克隆位點(diǎn)表達(dá)載體）的構(gòu)建 將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的pMD-18T/MCS質(zhì)粒與pTgf2-EF1α-EGFP質(zhì)粒利用限制性?xún)?nèi)切酶Hind III和SalI分別進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系（20 μL）：Hind III和SalI各 1 μL，10×K buffer 3 μL，pMD18-MCS質(zhì)粒或Tgf2 質(zhì)粒 3 μL，H2O 12 μL，37℃酶切3 h，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收。將回收的MCS片段與Tgf2質(zhì)粒大片段進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系（10 μL）：MCS回收產(chǎn)物7 μL，Tgf2質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物1 μL，T4連接酶1 μL，T4連接buffer 1 μL，16℃水浴連接過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)化，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌斑PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件1.2.2。反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后挑取陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確即獲得重組的表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MCS-EGFP。

1.2.4 pTgf2-EF1α-MCS-EGFP在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá) 將表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MCS-EGFP利用顯微注射的方法注射到1-2細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚(yú)受精卵中，置于培養(yǎng)皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：28℃，10∶14 h光周期，分別于注射12、24、40和72 h觀察報(bào)告基因EGFP表達(dá)情況。

1.2.5 pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP的構(gòu)建 將pMD18T/ MIPS質(zhì)粒與pTgf2-EF1α-MCS-EGFP質(zhì)粒利用ACSI和Xmal I（NEB）限制性?xún)?nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系（20 μL）：pMD18-MIPS質(zhì)?；騎gf2-MCS質(zhì)粒3 μL，ACSI和Xmal I各1 μL，buffer 4 3 μL，BSA 0.2 μL，H2O 11.8 μL，37℃酶切3 h，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠回收，然后將回收的MIPS片段與pTgf2-EF1α-MCS-EGFP質(zhì)粒大片段進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件同1.2.3，然后轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆利用引物Tgf2-F（5'-ACAAGACGCTTACAGGCTGAATG-3'）和Tgf2-R（5'-CTTCCCATTCTAAACAACACCC-3'）進(jìn)行菌斑PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系同1.2.2，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min；反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確即獲得重組的表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP。

1.2.6 pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP質(zhì)粒在斑馬魚(yú)體內(nèi)的表達(dá)

1.2.6.1 熒光觀察 將表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPSEGFP利用顯微注射的方法注射到1-2細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚(yú)受精卵中，置于培養(yǎng)皿在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：28℃，10∶14 h光周期，分別于注射12、24、40和72 h觀察報(bào)告基因EGFP表達(dá)情況。

1.2.6.2 靶基因MIPS的PCR檢測(cè) 注射重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP的斑馬魚(yú)中表達(dá)EGFP陽(yáng)性個(gè)體人工養(yǎng)殖3個(gè)月后，剪取轉(zhuǎn)基因魚(yú)和野生型對(duì)照斑馬魚(yú)的尾鰭提取DNA，對(duì)靶基因MIPS進(jìn)行PCR檢測(cè)（正向引物：5'-TTGGCGCGCCATGCCTGAGAAA-GTTCGTATC-3'，反向引物：5'-TCCCCC CGGGTTATGAGACTGTATGTCGAATCTTC-3'），反應(yīng)體系同1.2.2，擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s、55.6℃ 30 s、72℃ 83 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min；反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，比較轉(zhuǎn)基因魚(yú)和對(duì)照魚(yú)是否有目的條帶來(lái)判斷MIPS基因是否整合到了斑馬魚(yú)基因組中。本研究所有分子試驗(yàn)操作參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［18］。

2 結(jié)果

2.1 MCS序列的PCR擴(kuò)增與克隆

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的MCS長(zhǎng)度為121 bp，經(jīng)PCR擴(kuò)增成功獲得雙鏈的MCS序列，將其克隆至PMD18-T質(zhì)粒中，菌落PCR及其測(cè)序均證實(shí)本研究設(shè)計(jì)的MCS序列有效（圖2）。

2.2 重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MCS-EGFP在斑馬魚(yú)中的表達(dá)

通過(guò)PCR方法獲得長(zhǎng)度為121 bp 的MCS序列，再通過(guò)酶切、連接等方法將MCS序列構(gòu)建到原始Tgf2質(zhì)粒中（圖3）。圖4是注射pTgf2-EF1α-MCSEGFP質(zhì)粒的斑馬魚(yú)體內(nèi)12、24、40、72 h后報(bào)告基因EGFP的瞬時(shí)表達(dá)熒光觀察結(jié)果。

2.3 重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑馬魚(yú)中EGFP的表達(dá)

通過(guò)顯微注射將重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP注射到斑馬魚(yú)中，分時(shí)段觀察EGFP在斑馬魚(yú)中瞬時(shí)表達(dá)情況。圖5是注射pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP質(zhì)粒的斑馬魚(yú)體內(nèi)12、24、40、72 h后報(bào)告基因EGFP的瞬時(shí)表達(dá)熒光觀察結(jié)果。

2.4 重組表達(dá)載體pTgf2-EF1α-MIPS-EGFP在斑馬魚(yú)中的PCR驗(yàn)證

取人工養(yǎng)殖3個(gè)月的EGFP表達(dá)陽(yáng)性斑馬魚(yú)和野生型對(duì)照斑馬魚(yú)尾鰭提取DNA，利用引物ACSIS10和XmalI-S10進(jìn)行目的基因MIPS的PCR檢測(cè)。圖6是40尾斑馬魚(yú)的PCR檢測(cè)結(jié)果，MIPS基因大小為1 660 bp。圖6結(jié)果顯示基因編碼區(qū)能夠完整的整合到斑馬魚(yú)基因組中，說(shuō)明Tgf2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因載體在斑馬魚(yú)中也有較高的轉(zhuǎn)基因效率。

3 討論

近年來(lái)由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為分子遺傳育種中的主流技術(shù)，不僅能使魚(yú)類(lèi)的優(yōu)良基因得到傳遞，也能使魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生新的變異，同時(shí)還能篩選出魚(yú)類(lèi)一些重要性狀的主控基因［5］以及進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲等研究［19］。例如，F(xiàn)ujimura等［20］利用Tol2轉(zhuǎn)座子獲得轉(zhuǎn)基因羅非魚(yú)；Huang等［21］通過(guò)Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)成功構(gòu)建了心肌特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)；Szeverenyi等［22］利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法鑒定水稻的功能基因。金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子作為hAT轉(zhuǎn)座子家族的新成員具有自主轉(zhuǎn)座活性，并與青鳉魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座子相似度達(dá)97%，表明Tgf2轉(zhuǎn)座子也可以作為魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因和增強(qiáng)子捕獲的研究［11，23］，有關(guān)Tgf2轉(zhuǎn)座子在魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用報(bào)道還很少，只有郭秀明［12］等利用金魚(yú)Tgf2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在團(tuán)頭魴成魚(yú)基因組中的表達(dá)以研究其插入的效率，結(jié)果顯示整合效率為31.5%，拷貝數(shù)至少為2個(gè)。

之前載體改造中MCS序列一般都是通過(guò)分子克隆獲得，這樣的序列不僅不能滿(mǎn)足大部分載體改造者的需求，如目的基因和MCS序列中沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)等，還會(huì)存在將MCS序列插入原始載體后出現(xiàn)排斥的現(xiàn)象，如目的基因不能表達(dá)［24，25］。本文是人工設(shè)計(jì)并合成一段符合特定需求的MCS序列并構(gòu)建到金魚(yú)Tgf2表達(dá)載體中，即在原始Tgf2質(zhì)粒EF1α啟動(dòng)子下游和報(bào)告基因EGFP上游區(qū)間插入MCS序列。由于MCS序列在EGFP基因的前面，當(dāng)pTgf2-EF1α-MCS-EGFP注射到斑馬魚(yú)中，可以通過(guò)能否看到報(bào)告基因EGFP的表達(dá)來(lái)判定此改造是否可行。將構(gòu)建得到的重組表達(dá)載體注射到斑馬魚(yú)中進(jìn)行載體的功能驗(yàn)證，一方面在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期都看到了EGFP的表達(dá)，構(gòu)建的含有人工合成MCS序列的pTgf2-EF1α-MCS-EGFP載體能夠在宿主體內(nèi)正確表達(dá)，表明該MCS序列并沒(méi)有影響報(bào)告基因的正常編碼，重組載體是有效的。MIPS插入MCS序列中GFP能夠表達(dá)，只是熒光強(qiáng)度減弱。由于原始載體中只有一個(gè)EF1α啟動(dòng)子，當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)兩個(gè)基因表達(dá)的時(shí)候勢(shì)必會(huì)減弱后續(xù)基因的表達(dá)效率，所以pTgf2-EF1α-MCS-MIPS-EGFP的EGFP的表達(dá)亮度會(huì)弱一些，可以在報(bào)告基因EGFP前再插入一個(gè)啟動(dòng)子來(lái)解決熒光表達(dá)弱的這個(gè)問(wèn)題；另一方面也進(jìn)行了PCR檢測(cè)，共檢測(cè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)86尾，其中含有靶基因MIPS的轉(zhuǎn)基因個(gè)體為27尾，整合效率達(dá)31.4%。

4 結(jié)論

本研究是為了解決大多數(shù)外源目的基因編碼序列無(wú)法插入到一些商業(yè)化載體中進(jìn)行基因功能驗(yàn)證的不足而人為設(shè)計(jì)并合成了一段含有11個(gè)酶切位點(diǎn)的MCS序列，序列中添加的ATAT結(jié)構(gòu)能夠防止各不同內(nèi)切酶對(duì)酶切位點(diǎn)的識(shí)別錯(cuò)誤，同時(shí)也防止了較多GC堿基所引起的甲基化作用。GGAACC序列為隨機(jī)添加，能夠平衡上下游PCR擴(kuò)增引物之間的退火溫度和GC含量，利于后續(xù)擴(kuò)增。再將其克隆至金魚(yú)Tgf2表達(dá)載體并注射到斑馬魚(yú)中通過(guò)觀察斑馬魚(yú)中EGFP的表達(dá)情況以及外源基因MIPS在斑馬魚(yú)體內(nèi)的整合情況驗(yàn)證其有效性，以此解決大多數(shù)外源目的基因編碼序列無(wú)法插入到一些商業(yè)化載體中進(jìn)行基因功能驗(yàn)證的不足。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Tgf2 Transposon Multiple Cloning Sites Cloning and Expression

Tao Ran1，2Chang Yumei2Liang Liqun2Tang Ran2Dou Xinjie2，3Wang Nan2，3Li Mingyun1
（1. College of Ocean，Ningbo University，Ningbo 315211；2.China National & Local United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding，Key Laboratory of Freshwater Aquatic Biotechnology and Genetic Breeding，Ministry of Agriculture，Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070；3. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

The goldfish pTgf2-EF1α-EGFP transposon vector was reconstructed by insertion of artificial synthesized multiple colning sites（MCS）. In order to examine its effectiveness, the recombinant vectors of pTgf2-EF1α-MCS-EGFP and pTgf2-EF1α-MCS-MIPS--EGFP containing the exogenous gene, Myo-inositol-3-phosphate synthase（MIPS）were injected into 1-2 cells of zebrafish embryos. Both fluorescence observation of GFP and PCR detection of exogenous gene sizes verified the effectiveness of the reconstructed vector, in spite of slight differences in fluorescent strength of GFP. Moreover, the reconstructed vector has a higher integration efficiency（31.4%）in the genome of zebrafish based on the results. The successful construction of recombinant expression vector displays goldfish Tgf2 transposon can mediate exogenous gene expression in zebrafish and it would be useful to Tgf2 transposon in gene function research of fish.

Goldfish Tgf2 transposon MCS sequence Transgenic zebrafish

2013-10-08

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2010CB126305）, 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(HSY201205)

陶然, 女, 碩士研究生,研究方向: 魚(yú)類(lèi)基因工程育種; E-mail：taoran0227@163.com

李明云, 男 ,教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向：種質(zhì)種菌工程、遺傳育種和分子遺傳，E-mail：limingyun@nbip.net；梁利群, 女, 研究員, E-mail：llq-1019@163.com