隗黎麗吳華東劉毅

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，南昌 330045；2. 江西師范大學生命學院，南昌 330022）

黃顙魚“裂頭病”病原二重PCR檢測方法的建立及應用

隗黎麗1吳華東1劉毅2

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，南昌 330045；2. 江西師范大學生命學院，南昌 330022）

“裂頭病”是黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的主要病害之一，其病原為鮰愛德華氏菌或遲鈍愛德華氏菌。以GenBank所收錄鮰愛德華氏菌與遲鈍愛德華氏菌16S rRNA基因為模板，優(yōu)化設(shè)計兩對特異性引物，經(jīng)多重PCR反應體系優(yōu)化及特異性與敏感性檢測，建立了檢測鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌的二重PCR檢測方法。結(jié)果顯示，陽性對照樣品的瓊脂糖凝膠電泳條帶同時檢測到鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌，擴增產(chǎn)物大小分別為470 bp及268 bp，靈敏度為1.38 ng/μL。此法用于檢測江西南昌地區(qū)多個養(yǎng)殖場所患“裂頭病”黃顙魚腦部DNA，11份患病黃顙魚的腦部組織均檢出鮰愛德華氏菌，表明該地區(qū)黃顙魚所患“裂頭病”的病原菌為鮰愛德華氏菌，此結(jié)果與常規(guī)細菌分離鑒定的檢測結(jié)果一致。所建二重PCR檢測法敏感度高，特異性強，檢測成本低，對黃顙魚“裂頭病”的快速診斷與流行病學調(diào)查有較好的應用價值。

黃顙魚 裂頭病 鮰愛德華氏菌 遲鈍愛德華氏菌 二重PCR

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）因其營養(yǎng)價值高，已成為一種名貴的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。近些年來，在養(yǎng)殖黃顙魚中流行一種 “裂頭病”或“紅頭病”的疾病，主要表現(xiàn)為頭頂穿孔，頭蓋骨開裂，甚至露出腦組織。國內(nèi)學者對患病黃顙魚病原研究發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖區(qū)域的黃顙魚病原不同，可能為遲鈍愛德華氏菌［1，2］或鮰愛德華氏菌［3-5］。目前，對黃顙魚的“裂頭病”病原的檢測主要采用傳統(tǒng)的細菌分離方法，而傳統(tǒng)的生理生化檢測方法費時費力（需要7 d左右），且操作復雜，敏感性較低。常規(guī)PCR反應一次只能檢測一種致病菌種，而目前可使黃顙魚發(fā)病的致病菌的可能為鮰愛德華氏菌或遲鈍愛德華氏菌菌，這就可能需要多次檢測才能確定致病菌，使得檢測時間延長，檢測費用增加，延誤治療。針對這種情況，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了多重PCR技術(shù)，目前已建立起針對兩種或多種致病菌的多重PCR檢測技術(shù)［6-11］。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對引物，對多個目的基因同時進行擴增的分子生物學方法，可同時檢測多種病原體或多個基因型，從而達到對多種疾病的同步診斷，縮短檢測的時間［12］。為了實現(xiàn)對不同區(qū)域養(yǎng)殖黃顙魚“裂頭病”病原菌的快速檢測和監(jiān)控，本試驗探討建立二重PCR技術(shù)，一次性檢測鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌，以期為黃顙魚愛德華菌病提供一種快速準確、高效經(jīng)濟的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

柱狀黃桿菌，中國科學院水生生物研究所魚類免疫學學科組饋贈，該菌的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方參考文獻［13］的方法。鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌均為本實驗室分離株，金黃色葡萄球菌來自于江西農(nóng)業(yè)大學微生物學實驗室。其中，鮰愛德華氏菌、遲鈍愛德華氏菌分別采用腦心浸（BHI）液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24 h。2×TaqPCR MasterMix購買于天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL1000購買于大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖和細菌DNA基因組抽提試劑盒購買于全式金生物技術(shù)有限公司；多重PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 二重PCR引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的遲鈍愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌的16S rRNA基因序列（序列號分別為AY626368和AB100170），同時參考文獻［9］，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計2對特異性PCR引物，序列見表1。

1.2.2 細菌DNA提取 細菌DNA基因組按全式金細菌DNA基因組抽提試劑盒的說明書要求提取，紫外分光光度計測定模板DNA的濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二重PCR反應條件的優(yōu)化 將兩種菌的DNA模板等量混合后，對影響二重PCR反應效果的引物濃度、退火溫度以及2×TaqPCR Master濃度進行調(diào)整和優(yōu)化，確定最佳反應條件。

1.2.4 引物特異性的驗證 從柱狀黃桿菌、金黃色鏈球菌、嗜水氣單胞、鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌中提取DNA模板，進行多重PCR擴增，檢驗引物特異性。

1.2.5 二重PCR靈敏度的測定 將兩種目標菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)期，采用試劑盒提取DNA模板，檢測二重PCR方法的靈敏度，紫外分光光度計測定模板DNA的濃度。然后將模板進行10倍系列稀釋，檢測二重PCR的靈敏度。

1.2.6 二重PCR方法對黃顙魚腦組織的檢測 對2012年7月至9月在江西南昌蔣巷和毛蓮湖的11份臨床疑似病料進行檢測，11份疑似病料的病理癥狀均出現(xiàn)不同程度的頭頂充血、出血、發(fā)紅，顱骨頂部皮膚潰爛，鰭條基部出血，肛門及生殖孔充血、出血、外突等特征（圖1）。將疑似病料的腦組織，用全式金DNA基因組抽提試劑盒進行DNA的抽提，根據(jù)說明書的具體步驟進行操作，然后采用二重PCR方法檢測所抽提的DNA模板。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR反應條件的優(yōu)化

2.1.1 引物濃度的優(yōu)化 先將鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌正反向引物（10 μmol/mL）等體積混合，在15 mL PCR反應體系中，添加混合引物0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μL進行二重PCR擴增，結(jié)果（圖2）顯示，不同濃度的引物均可以擴增出條帶，條帶明亮清晰，條帶之間互不干擾，無拖尾，但當引物濃度增加到0.4 μL時，就可見二聚體產(chǎn)生，隨后，引物濃度越大，二聚體越明顯，非特異性擴增條帶亮度明顯增加。因此，最適引物添加量為0.2 μL。

2.1.2 2×TaqPCR Master濃度的優(yōu)化 使用的是2×TaqPCR Master，15 μL反應體系中其添加量依次為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL。擴增結(jié)果（圖3）顯示，2×TaqPCR Master添加量為7.5 μL時擴增的條帶效果最為理想。

2.1.3 退火溫度的優(yōu)化 為了摸索最佳的退火溫度，依次設(shè)置了53、54、55和56℃作為退火溫度。結(jié)果（圖4）顯示，退火溫度在55℃時條帶明亮清楚，無非特異性擴增。

2.1.4 二重PCR反應條件的確定 在相同反應條件下，本著條帶較亮、二聚體較少、試劑用量較少的原則，確定反應條件。即在15 μL反應體系中，鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌上下游引物用量分別為0.1 μL，2×TaqPCR Master 7.5 μL，ddH2O 6.3 μL，鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌的cDNA模板用量為0.5 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增條帶見圖5。

2.2 二重PCR的引物特異性

提取柱狀黃桿菌、金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的DNA，用所設(shè)計的引物進行擴增（圖6），顯示為陰性。

2.3 二重PCR反應的靈敏度

分別用紫外分光光度計測定所提取的鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌DNA的濃度，將其等濃度混合，其終濃度為1.38 ng/μL；將混合的DNA 10倍稀釋，進行PCR擴增。結(jié)果（圖7）顯示，濃度為138、13.8和1.38 ng/μL的稀釋模板可以擴增出目的條帶，即該PCR方法可檢測的最低的DNA的量為1.38 ng。

2.4 二重PCR對患病黃顙魚腦組織DNA的檢測

通過對2013年7月在南昌市附近不同黃顙魚養(yǎng)殖場采集的11份患病黃顙魚腦組織樣本進行二重PCR檢測，結(jié)果顯示（圖8）在11份患病黃顙魚的腦組織中均檢出了鮰愛德華氏菌。

3 討論

影響二重PCR反應效果的因素較多，其中引物設(shè)計的好壞直接關(guān)系到PCR 擴增的特異性和成功與否。其次還需要通過調(diào)整優(yōu)化二重PCR反應體系和條件參數(shù)以使多重PCR 檢測效果得到最佳。本試驗中遲鈍愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌引物濃度在0.07-0.24 μmol/mL（添加體積為0.2-0.7 μL）之間擴增都可以出現(xiàn)條帶。但以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且看增加引物之間形成二聚體的機會。因此，確定最優(yōu)化的引物濃度為0.1 μmol/L，即15 μL PCR反應體系中遲鈍愛德華氏菌和鮰愛德華氏菌引物的添加體積分別為0.1 μL。

二重PCR反應體系中同時進行多個擴增反應，不同反應之間對TaqDNA聚合酶存在競爭，將會使效率相對較低的DNA擴增受到抑制。在二重PCR體系中加入適量TaqDNA聚合酶可以減弱抑制作用。本研究中使用的是2×TaqPCR Master擴增試劑盒，該試劑盒包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑、濃度為2×。具有快速簡便、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可最大限度的減少人為誤差。

為了降低成本和尋找最佳的反應濃度，本試驗設(shè)置了不同的15 μL反應體系2×TaqPCR Master添加量分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能擴增出條帶，但是濃度太低，條帶則不亮，而濃度太高，又發(fā)現(xiàn)有非特異性擴增，因此，在15 μL PCR反應體系中2×TaqPCR Master的添加量為7.5 μL。

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量，退火溫度過高會導致引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降，退火溫度低，PCR反應的產(chǎn)量提高，但過低可造成引物與模板錯配，易出現(xiàn)非特異性擴增。本試驗中，設(shè)置了53、54、55和56℃ 4個退火溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了56℃擴增時，條帶不明顯外，其他均能擴增出條帶，但綜合考慮，用55℃擴增時，條帶穩(wěn)定性強，可獲得很好的擴增效果。

通過對患病黃顙魚腦組織樣本進行二重PCR檢測，結(jié)果均檢出了鮰愛德華氏菌，這與我們采用傳統(tǒng)細菌分離鑒定的方法（已投稿）檢測的結(jié)果相符。此外，本試驗的靈敏度達到了1.38 ng/μL，顯示該方法是很靈敏的。因此該技術(shù)不但可以用于對該病的診斷，而且還可以用于帶菌魚的診斷。

4 結(jié)論

本研究建立的二重PCR方法操作簡單，快速，具有很好的特異性，能夠準確鑒定和區(qū)分鮰愛德華氏菌和遲鈍愛德華氏菌兩種菌，可以應用于臨床樣品中鮰愛德華氏菌或遲鈍愛德華氏菌的單個或混合感染的檢測。

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（責任編輯 李楠）

Establishment and Application of Duplex PCR to the Pathogen of“Cracked Head” from Yellow Catfish（Pelteobagrus fulvidraco）

Wei Lili1Wu Huadong1Liu Yi2
（1. College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045；2. College of Life Sciences，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022）

“Cracked head disease” is one of the major diseases in cultured yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. In this study, two special oligonucleotide primers for duplex PCR amplication were designed to detect the pathogen of“cracked head disease”from yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）. The reaction conditions of the duplex PCR were optimized and PCR products were sequenced. Specificity and sensitivity of duplex PCR were studied. Finally, the duplex PCR is well developed successfully allowing the detection of the two bacterial pathogens in one PCR tube with relatively equal intensities DAN bands when analyzed in an agarose gel. The result showed the expected DNA fragments of 470 bp and 268 bp were observed, respectively. The sensitivity of duplex PCR was 1.38 ng/μL. When it was applied to detect the bacterial in brain of fish which were naturally infected in Nanchang, Jiangxi Province, Edwardsiella ictaluri was detected in 11 diseased samples of yellow catfish. The result was coherence with that of traditional technology of physiology and biochemistry, which showed that the duplex PCR could be used not only to diagnose the diseased yellow catfish but also to monitor the fish infected by bacteria. It can be concluded that the duplex PCR is specific and sensitive. It is a reliable tool for identification of the Edwardsiellosis with less time and cost, and it can be used in quick diagnose and epidemiology investigation of bacterial of “Cracked head disease” from yellow catfish.

Yellow catfish Cracked head disease Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda Duplex PCR

2013-09-24

江西省科技廳項目（20114BAB214002，20111BBF60021，20121BBF60034）

隗黎麗，女，講師，博士，研究方向：魚類免疫學的教學與研究；E-mail：hbliliwei@163.com

劉毅，男，副教授，博士，研究方向：魚類免疫學的教學與研究；E-mail：yiliusan@sina.cm