武一琛，楊慧茹，方園，任秀蓮

（哈爾濱工業(yè)大學（威海）海洋科學與技術學院，山東威海264209）

蝦青素（Astaxanthin）即 3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮，由于結構內部的共軛不飽和雙鍵，是一種極強的抗氧化劑，在抗氧化、著色、促進動物繁殖、增強人體免疫能力、保護心腦血管及中樞神經方面具有優(yōu)良的生物學功能[1]，可以作為自由基清除劑和免疫調節(jié)劑[2]等應用。

天然蝦青素富含于蝦蟹的殼、雨生紅球藻、法夫酵母等[3]。目前我國海洋蝦蟹制品下腳料利用率極低，大部分都是直接丟棄。如果把蝦蟹制品的下腳料加以回收，提取其中的蝦青素并進行有效的利用，在給企業(yè)帶來不菲的經濟效益的同時，也減少了環(huán)境的污染，提高了蝦蟹下腳料的綜合利用率，具有極其廣闊的應用前景。雨生紅球藻和法夫酵母生長周期短，便于人工的養(yǎng)殖和控制，在提取天然蝦青素方向同樣有巨大的發(fā)展空間，近年來一直是國內外專家學者研究的熱點問題。

1 天然蝦青素提取工藝

天然蝦青素的提取方法有堿提法、酸溶法、有機萃取法、負壓空化法、酶解法、超臨界流體萃取法、微波處理提取法等，其中堿提法和酸溶法由于工藝落后，需要消耗大量堿和有機酸，直接導致污水排放增加，對環(huán)境中水源污染嚴重，近幾年已逐漸退出歷史舞臺。

1.1 有機萃取法

有機萃取法是通過有機溶劑萃取而使目標產物進行富集從而分離。常用的有機萃取劑有乙醇、丙酮、甲醇、苯、石油醚等，根據目標產物的極性和其它理化性質，不同的有機溶劑的萃取效果不同。

MIQUEL GIMENO 等[4]通過用乙醇，丙酮，1，1，1，2-四氟乙烷液體溶劑對蝦殘留物萃取天然游離蝦青素，通過HPLC分析，丙酮萃取游離蝦青素的提取率最高，達115 μg/g蝦殘留物。此外，液態(tài)的四氟乙烷為首次作為溶劑成功提取分離出天然蝦青素。這與Ruenngam D等[5]的研究結果結論一致。Ruen-ngam D研究發(fā)現(xiàn)：利用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑萃取雨生紅球藻中的蝦青素，丙酮的提取率最高。

絕大多數(shù)的有機溶劑有毒性，隨著科技的發(fā)展和標準的提高，殘留的有機溶劑的毒性大大制約了有機萃取法的發(fā)展，于是各種新型方法不斷涌現(xiàn)。

1.2 負壓空化法

負壓空化法是一種新興的提取方法，通過負壓空化氣泡產生劇烈的機械振動，從而使細胞壁破裂，目標提取物從中分離出來。由于負壓產生的強烈的壓強差，使提取溶劑在瞬間進入細胞壁，大大縮短了提取分離的時間，具有廣闊的應用前景[6]。目前研究采用負壓空化法提取天然蝦青素的主要有東北林業(yè)大學等。

祖元剛等[6]對負壓空化法進行了優(yōu)化和處理，研究發(fā)現(xiàn)：提取溶劑為質量分數(shù)80%的乙醇溶液、提取時間為35 min、通氣量為0.2 m3/h時，為提取法夫酵母中的蝦青素的最佳工藝參數(shù)，且不會破壞法夫酵母的細胞壁。

1.3 酶解法

酶解法是對原料蝦殼蟹殼進行預處理后，加入一定的具有生物活性的酶對其中的蛋白質進行酶解，沉降分離蛋白質的同時分離制取蝦青素的方法。Toshihiro Nagao等[7]利用銅綠假單胞菌脂肪酶分離出蝦青素，趙儀等[8]研究發(fā)現(xiàn)利用木瓜蛋白酶處理廢棄的蝦殼，使蛋白質沉降同時分離蝦青素的方法比利用有機溶劑提取的提取率提高了19.879%，達到63.059μg/g。蹇華麗等[9]采用單因素及均勻實驗法將環(huán)狀芽孢桿菌胞壁溶解酶作用于法夫酵母，研究發(fā)現(xiàn)了破壁提取蝦青素的最佳酶作用條件，即粗酶液pH為5.0，體積為33 mL（酶量1 603.8 U/g干酵母），溫度37℃，100 r/min振蕩反應16.5 h蝦青素的提取率可達到98%以上。姜淼等[10]研究內源酶輔助提取蝦殼中的天然蝦青素的實驗也取得了一定進展。

為解決直接加酶導致成本過高的問題，可以嘗試將產酶菌株與法夫酵母或者雨生紅球藻共同進行培養(yǎng)[11]，但是由于適宜的生長條件：pH、水分、培養(yǎng)基成分、溫度等都不相同，所以該方法進展緩慢。酶解法提取的蝦青素具有無毒、無溶劑殘留、操作簡便等優(yōu)點，只要解決了成本問題，酶解法分離蝦青素就可以產業(yè)化，具有極大的經濟效益和發(fā)展前景。

1.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取技術利用超臨界流體的性質，高壓條件時與蝦殼粉碎物接觸并混合，萃取出其中的蝦青素，之后再利用改變條件的方法使超臨界流體中的萃取物分離出來。超臨界流體萃取法在蝦青素的提取方面的主要手段是超臨界CO2流體法。

Siti Machmudah等[12]研究超臨界CO2流體法提取天然蝦青素，發(fā)現(xiàn)以乙醇作為夾帶劑時，提取率更高。屈毅等[13]運用超臨界CO2流體法研究發(fā)現(xiàn)：最佳萃取工藝參數(shù)為萃取壓力40 MPa，萃取溫度60℃，此時蝦殼中蝦青素的提取率可達到80.5%，并且得到的副產物（蝦油等）較少。Hyun-Seok Youn等[14]，劉洪超等[15]也探討了超臨界CO2流體提取蝦青素的方法。

超臨界流體萃取法是利用物理原理對目標物質進行分離的方法，無毒性和有害殘留，而且分離較徹底。同時，超臨界流體法目前只是處于實驗室研究階段，想要投入工業(yè)生產中存在機器費用及維修費用高、生產技術復雜、整個工藝流程具有不確定隱患的一系列困難。已經有越來越多的專家學者投入到了這方面的研究中。

1.5 微波處理提取法

微波處理提取法是用不同波長和頻率的微波處理含有目標提取物的混合物，使其理化性質發(fā)生改變而提高提取率的方法。目前微波處理提取法用于天然蝦青素分離提取的研究還處于初步的嘗試階段。Liyan Zhao等[16]研究發(fā)現(xiàn)在條件：微波功率為141 W，提取時間為83 s，溶劑用量9.8 mL，提取4次時，100 mg雨生紅球藻的干燥粉末可以提取約（594±3.02）μg天然蝦青素，這一研究創(chuàng)造了微波法用于提取天然蝦青素的記錄。

2 天然蝦青素分離純化工藝

純化就是把經過粗提的樣品中所含有的雜質除去，使目標物質的純度最大化的過程。常用的初級分離純化方法分為：液-液萃取、沉淀法、膜分離法、結晶法等。更高級的分離純化還有：薄層層析、柱層析、高效液相色譜等方法[17]。

針對天然蝦青素極其不穩(wěn)定、易分解、易變質的性質，學者們對天然蝦青素的分離純化做了多層次、多角度的研究，并取得了一些成果。

2.1 薄層層析

薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）的固定相多為硅膠，不會對蝦青素產生影響，但由于薄層層析的分離度不高，結果受外界干擾因素大，重現(xiàn)性差，不便于實驗操作，所以對操作過程要求極高。

郭建瑞等[18]在研究中選用石油醚、丙酮、乙酸乙酯兩兩組合作為流動相進行比較分析。通過改變其組成比例發(fā)現(xiàn)：石油醚乙酸乙酯質量比為2∶1（體積比）的展開劑分離效果較好，薄板上分離出清晰的4個點。陳興才等[19]在研究蝦青素分離純化時，也應用了薄層層析的方法。

2.2 柱層析

柱層析是最常用的純化方法之一，與其他色譜方法相比，柱層析設備低廉，更換固定相和流動相方便；雖然柱效不是特別高，但是利用不同固定相和流動相的組合能夠實現(xiàn)一些相對簡單樣品的分離與純化，應用范圍很廣。

黃萌[20]在蝦青素的分離純化中采用柱層析的方法，游離蝦青素在流動相為正己烷與丙酮1∶1（體積比）時被洗脫下來，純度達到99.36%。楊磊等[21]采用連續(xù)中壓硅膠柱層析純化蝦青素得到純度大于97%的蝦青素產品，平均回收率大于60%。張琇等[22]以聚酰胺為固定相，獲得蝦青素的純度為92.9%。

2.3 高效液相色譜法

高效薄層色譜法（High Performance Thin Layer Chromatography，HPTLC）已經在天然產物的分離與純化領域得到了廣泛應用，成為一種簡便、高效的分析方法。

陳興才等[17]使用高效液相色譜法結合折光示差檢測器對蝦青素的純度進行了測定達到98%以上。Karsten Holtin[23]等也利用HPLC分析出了蝦青素的合適吸收值。牟志春等[24]建立了蝦青素手性異構體分離和檢測的HPLC方法，用來快速鑒別養(yǎng)殖三文魚是否使用了人工合成蝦青素。

與薄層層析和柱層析相比，高效液相色譜的儀器價格高昂，需要定時維修檢查，使用時對儀器的磨損度大，無法在工業(yè)企業(yè)中大規(guī)模普及。

3 結語及展望

由于蝦青素本身極其不穩(wěn)定的性質，在其提取與分離純化中有重要影響。在蝦青素的提取中，負壓空化法、酶解法、超臨界流體萃取法、微波處理提取法都是一些新興的分離方法，具有廣闊的發(fā)展和應用前景。相信在不遠的將來，這些方法會應用于工業(yè)化生產；在分離純化方面，層析法應用最為廣泛，HPLC法分離效果更好，造價高。

蝦青素具有抗氧化、著色等功效，梁春瑋等[25]總結出蝦青素具有明顯的抗癌和改善人體視網膜和骨質量的功效，在藥物及食品方面應用廣泛；同時具有顯著的著色功能，未來可以研究用蝦青素代替被禁止使用的蘇丹紅IV給食品進行染色。同時，我們要看到國外已經有成熟的蝦青素生產技術和專利，如日本的Toshihiro Nagao等[7]已經把酶解法分離雨生紅球藻中的蝦青素應用于大規(guī)模的工業(yè)生產，如果國內在這個領域有所成就，對蝦青素的價格居高不下和技術的掌握都有重大意義。

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