劉偉偉 夏親華 劉音吟 朱萱萱

(南京中醫(yī)藥大2011級碩士研究生在讀，江蘇 南京 210046)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以卵泡發(fā)育障礙、胰島素抵抗和雄激素過多為其特征性改變的、病因復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌疾病，育齡婦女的發(fā)生率約為5% ～10%［1］。PCOS患者在妊娠后極易發(fā)生自然流產(chǎn)。有報道，PCOS患者在妊娠最初3個月內(nèi)流產(chǎn)率高達20% ～50%［2］。Cocksedge等［3］在研究流產(chǎn)與 PCOS 的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者4.8% ～82%存在卵巢多囊樣改變，15%～26%存在高雄激素血癥。臨床資料也表明，PCOS患者經(jīng)治療后妊娠，雖血人體絨(毛)膜促性腺激素(HCG)呈進行性升高，但妊娠6～8周后易出現(xiàn)自然流產(chǎn)或胚胎凋萎，即使進行黃體期支持也無法改變其流產(chǎn)結(jié)局。PCOS患者經(jīng)促排卵治療后，其排卵障礙可被成功糾正，但最終妊娠率低，自然流產(chǎn)率高。近年來，腫瘤壞死因子(TNF)與PCOS的發(fā)病機制愈來愈受到關(guān)注，且TNF-α參與妊娠的生理及病理過程，妊娠期異常分泌的大量TNF-α可能損害胎兒生長，引起流產(chǎn)和早產(chǎn)。而PCOS患者體內(nèi)高水平的TNF-α?xí)绊懭焉锏倪M程，導(dǎo)致流產(chǎn)和早產(chǎn)等危險。本實驗通過脫氫表雄酮建立PCOS大鼠模型，研究中藥泰山磐石散對PCOS妊娠模型大鼠血清TNF-α及妊娠結(jié)局的影響，探討TNF-α與妊娠的關(guān)系及本方改善PCOS妊娠結(jié)局的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 21日齡雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量(60±15)g，購自南通大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號SCXK(蘇)2008-001。飼養(yǎng)條件:室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度50%～70%，晝夜各12 h間斷照明。自由攝取水和食物，飲水為自來水，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，每周更換3次墊料。實驗飼料及墊料均由南通大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 主要儀器 TNF-α試劑盒、抗體均購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司;SpectraMax M2多功能酶標儀，美國Molecular Devices Corporation(MDC)公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥物及試劑 枸櫞酸氯米芬膠囊(塞浦路斯高特制藥有限公司，進口藥品注冊證號H20091079);注射用脫氫表雄酮(珠海遠城醫(yī)藥化工有限公司，批號H110312);地屈孕酮片(荷蘭 SolvayPharmaceuticalsB.V，國藥準字H20090470);泰山磐石散顆粒，藥物組成:黨參10 g，白術(shù)10 g，白芍藥 12 g，熟地黃 10 g，當歸 8 g，川芎 8 g，川續(xù)斷15 g，黃芩 10 g，炙甘草 3 g，砂仁(后下)5 g，苧麻根 10 g。由江蘇省中醫(yī)院制劑室經(jīng)提取、加工、干燥成顆粒劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCOS模型制備及分組 參照Anderson等［4］方法采用脫氫表雄酮建立PCOS大鼠模型。取21日齡雌性SD大鼠90只，分別編號，用隨機數(shù)字表法分為2組，70只為模型組，20只為空白對照組。2組大鼠均于21日齡斷乳，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，于23日齡(實驗第1 d)開始，模型組大鼠每日8:00予注射用脫氫表雄酮6 mg/100 g體質(zhì)量+注射用大豆油0.2 mL頸背部皮下注射，每日1次;空白對照組大鼠予注射用大豆油0.2 mL頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)30 d。模型組于注射第20 d時開始每日觀察陰道涂片，經(jīng)陰道涂片顯示大鼠始終處于動情間期，無動情周期變化、無排卵。于第30 d模型組和空白對照組大鼠，眼眶靜脈采血，模型組血清激素睪酮值升高為造模成功。于80日齡起，模型組大鼠用枸櫞酸氯米芬10 mg/100 g體質(zhì)量每日1次灌胃，連續(xù)5 d促排卵后，模型組大鼠及空白對照組大鼠與雄鼠按1∶1合籠，次日以發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1 d，并分為正常妊娠組、PCOS妊娠空白組、PCOS妊娠中藥組及PCOS妊娠西藥組，每組各20只。

1.2.2 給藥方法 妊娠第1 d開始，PCOS中藥組予泰山磐石散顆粒溶液(即將每劑泰山磐石散顆粒加水111 mL配制而成，含生藥0.909 g/mL)1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃給藥，PCOS妊娠西藥組予等容積地屈孕酮溶液(即將地屈孕酮每片10 mg，約加水55 mL配制而成，含生藥0.18 mg/mL)灌胃，PCOS妊娠空白組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。均每日1次，連續(xù)5 d。正常妊娠組不進行任何干預(yù)。

1.2.3 標本采集及制備 以上各組孕鼠均于妊娠第5 d 14:00時各取6只，眼眶靜脈采血，以血1 mL∶肝素10 μL比例將肝素加于血內(nèi)，離心，取上清，置于-20℃冰箱中保存待行血清TNF-α的測定。操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。妊娠第8 d 16:00時另取各組孕鼠6只，脫臼處死，取雙側(cè)子宮，記錄孕鼠數(shù)及胚胎著床數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠體質(zhì)量比較 見表1。

表1 2組大鼠體質(zhì)量比較g，±s

表1 2組大鼠體質(zhì)量比較g，±s

與空白對照組造模后比較，△P＜0.05

組 別 n 造模前 造模后空白對照組20 55.50±6.79 178.80±13.53模型組 70 58.22±6.35 190.78±11.97*

由表1可見，造模前2組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);造模后模型組大鼠體質(zhì)量高于空白對照組(P＜0.05)。

2.2 各組孕鼠血清TNF-α比較 見表2。

由表1可見，PCOS妊娠空白組血清TNF-α水平較正常妊娠組明顯升高(P＜0.05)，而PCOS妊娠中藥組及PCOS妊娠西藥組血清TNF-α較PCOS妊娠空白組降低(P＜0.05)，與正常妊娠組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組孕鼠血清TNF-α比較ng/mL，±s

表2 各組孕鼠血清TNF-α比較ng/mL，±s

與PCOS妊娠空白組比較，*P＜0.05

組 別 n TNF-α(ng/mL)正常妊娠組 6 0.739 3±0.366 2*PCOS妊娠空白組 6 1.585 5±0.496 5 PCOS妊娠中藥組 6 0.975 1±0.411 6*PCOS妊娠西藥組 6 0.934 5±0.170 1*

2.2 各組孕鼠胚胎著床平均數(shù)比較 見表3。

表3 各組孕鼠胚胎著床平均數(shù)比較

由表3可見，PCOS妊娠空白組胚胎著床平均數(shù)少于正常妊娠組(P＜0.05)，而PCOS妊娠中藥組及PCOS西藥組胚胎著床平均數(shù)較PCOS妊娠空白組增多(P＜0.05)，且與正常妊娠組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

3.1 TNF-α與PCOS TNF-α屬TNF家族中的一員，它具有許多重要的生物學(xué)功能，包括抗瘤、抑瘤，促進細胞生長，誘導(dǎo)細胞分化、凋亡，調(diào)節(jié)機體組織糖、脂肪代謝。在正常情況下，血漿中有較低水平的TNF-α，對維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用。高濃度的TNF-α抑制卵巢顆粒細胞上胰島素生長因子-1(IGF-1)誘導(dǎo)的b合成，從而影響卵泡質(zhì)量及正常發(fā)育。Wu等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者卵泡細胞中存在高水平TNF-α表達，且高TNF-α和高體質(zhì)量指數(shù)與低白細胞介素6(IL-6)mRNA的表達存在一定的關(guān)系。Sayin等［6］也報道，在正常體質(zhì)量的PCOS伴高雄激素血癥患者中，無論是否存在PCOS的其他表現(xiàn)，均表現(xiàn)出明顯升高的TNF-α水平。

3.2 TNF-α與妊娠 TNF-α是由激活的單核-巨噬細胞產(chǎn)生和分泌的多肽類物質(zhì)。研究表明，TNF-α對胚胎著床有重要調(diào)節(jié)作用，并參與了妊娠全過程的調(diào)節(jié)作用［7］。適量分泌TNF-α可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的正常增殖、分化和凋亡，促進婦女能量代謝及胚胎發(fā)育，提高孕激素及人絨毛膜促性腺激素(HCG)的合成，對妊娠的維持起著重要作用［8］。當外周血中TNF-α增加時，可抑制黃體功能，促進黃體退化，導(dǎo)致孕酮的合成下降，內(nèi)分泌紊亂，最終引起流產(chǎn)。Arslan等［9］研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)患者伴有血清TNF-α的異常升高，母胎界面局部產(chǎn)生的TNF-α有94%釋放于母體外周血循環(huán)中［10］。龍鳳宜等［11］發(fā)現(xiàn)，TNF-α與流產(chǎn)的關(guān)系密切。TNF-α主要結(jié)合在蛻膜的間質(zhì)和血管內(nèi)皮細胞膜上［12］，由此激活蛻膜間質(zhì)中的免疫活性細胞，導(dǎo)致免疫排斥，產(chǎn)生臨床上早期流產(chǎn)。

綜上所述，TNF-α作為一種具有多種生物學(xué)功能的細胞因子，參與受精、著床和妊娠的生理及病理環(huán)節(jié)，妊娠期異常分泌的大量TNF-α可能損害胎兒正常生長，引起流產(chǎn)和早產(chǎn)。而PCOS患者體內(nèi)高水平的TNF-α無疑會影響妊娠的進程，導(dǎo)致流產(chǎn)和早產(chǎn)等危險。PCOS由于自身內(nèi)分泌紊亂的病理環(huán)境不利于胚胎的生長發(fā)育，即使給予調(diào)整月經(jīng)周期及糾正排卵，仍存在低妊娠率、高流產(chǎn)率的現(xiàn)象。為了研究中醫(yī)及西醫(yī)治療方法對PCOS妊娠結(jié)局的干預(yù)作用，以及TNF-α濃度水平與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，以更好的指導(dǎo)臨床，設(shè)計了本實驗。

中醫(yī)學(xué)認為，PCOS發(fā)生不孕及流產(chǎn)的根本原因是腎精虧虛，沖任匱乏，氣血失調(diào);而PCOS流產(chǎn)的發(fā)展演變過程又常與脾虛相關(guān)，因此補腎在其防治中起主導(dǎo)作用，而健脾起協(xié)同作用。應(yīng)用泰山磐石散加減補氣養(yǎng)血，固腎健脾安胎，對PCOS的不良妊娠結(jié)局有很大的扭轉(zhuǎn)和改善作用。泰山磐石散出自《古今醫(yī)統(tǒng)大全》，功能益氣健脾，養(yǎng)血安胎，適宜氣血虛弱所致的墮胎、滑胎、胎動不安，是臨床常用的安胎、保胎方。方以黨參、白術(shù)、炙甘草益氣健脾以固胎元;當歸、川芎、白芍藥、熟地黃補血養(yǎng)血調(diào)血以養(yǎng)胎元;川續(xù)斷、熟地黃、白芍藥合用，益肝腎而保胎元;砂仁調(diào)氣安胎;黃芩、白術(shù)、苧麻根健脾清熱，為安胎的要藥。諸藥合用，使氣血調(diào)和，沖任得固，胎孕得安。現(xiàn)代藥理研究亦表明，上述中藥可通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能而發(fā)揮安胎的作用［13］。本實驗結(jié)果提示，PCOS妊娠大鼠血清TNF-α水平較正常妊娠大鼠偏高，泰山磐石散及西藥地屈孕酮能在一定程度上降低血清TNF-α的水平，并能提高胚胎著床率。證實泰山磐石散及地屈孕酮能改善PCOS大鼠血清TNF-α的水平，提高妊娠率，降低流產(chǎn)率。本實驗結(jié)果說明，血清中TNF-α濃度水平與妊娠結(jié)局存在一定相關(guān)性，日后有望成為預(yù)測流產(chǎn)的指標之一，從而為中醫(yī)藥改善PCOS妊娠結(jié)局方面提供理論和方法依據(jù)。

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